一例牛結節性皮膚病的診斷與防治

馬 龍，李 莉，王玉梅，尹 才，李 杰，王曉亮，李知新

（寧夏回族自治區動物疾病預防控制中心，寧夏 銀川 750000）

1 流行概況

A場存欄奶牛4 650頭，2020年8月28日引進奶牛420頭。據該場技術人員反映，2020年10月20日，該批牛體表皮膚陸續出現丘疹、破潰、結痂等癥狀。10月22日，1頭牛因后肢損傷嚴重死亡。10月31日，對該場引進奶牛按山羊的5倍劑量，免疫吉林和元生物工程有限公司山羊痘活疫苗。經調查，目前該批調入牛有20%左右表現出疑似牛結節性皮膚病臨床癥狀。

B場存欄奶牛1 427頭，2020年10月16日引進奶牛197頭（該批牛起運時共200頭，運輸途中死亡3頭）。據調查，該批奶牛入場后發現有個別牛體表皮膚出現數量不等的小丘疹。10月27日，對該場所有奶牛按山羊的5倍劑量，全部免疫金宇保靈生物藥品有限公司山羊痘活疫苗。

C場存欄奶牛1 146頭，2020年10月13日引進奶牛420頭。入場時，個別牛皮膚上有丘疹，但沒有引起足夠關注。

2 臨床癥狀

患病奶牛精神沉郁，不愿活動；食欲減退，流淚流涎；體溫升高，發熱后皮膚出現10～50 mm的結節，通常均勻分布在全身；病變部位出現潰瘍，吸引蠅蚊，反復結痂。結痂附近有明顯炎癥，皮膚組織有出血性滲出液，呈黃色。

3 實驗室檢測

3.1 材料

單道微量移液器和多道微量移液器（Eppendorf公司）；IQ5高速熒光定量PCR儀（美國伯樂BIO-RAD公司）；一次性移液器吸頭（Axygen公司）；牛結節性皮膚病病毒熒光PCR檢測試劑盒、引物探針由青島立見診斷技術發展中心提供；核酸提取試劑盒（磁珠法）購自蘇州天隆生物科技有限公司（批號20082510T014）。

3.2 樣品采集 采集疑似發病牛只破潰結痂組織、口鼻拭子樣品15份，利用熒光PCR方法檢測牛結節性皮膚病病毒（LSDV）。

3.3 檢測方法

3.3.1 樣品處理 采集疑似發病牛只組織樣品，取少許加入石英砂，充分研磨，加入pH7.4 PBS緩沖液，制成1∶5～1∶10懸液，反復凍融3次，8 000 rpm離心2 min，取上清液56℃水浴消化1 h備用，作為PCR試驗材料。

3.3.2 DNA提取 病毒總DNA按照蘇州天隆生物科技有限公司試劑盒說明書提取。對疑似發病牛只及同群牛進行牛結節性皮膚病病毒熒光PCR檢測。

3.3.3 基因擴增 將引物探針和酶反應液瞬時離心后，將酶反應液全部移至引物探針中，顛倒混勻6次，充分混勻，配制成PCR反應液。

根據檢測樣品數量，每個PCR反應管加入20 μlPCR反應液；先取5 μl陰性對照、再取5 μl待檢DNA、最后取5 μl陽性對照（充分混勻）分別加到不同的PCR反應管中，加樣結束后蓋緊PCR反應管。熒光PCR反應條件為50℃預變性2 min；95℃變性5 min；95℃變性15 s，58℃延伸60 s，共40個循環。設置58℃收集FAM熒光信號。

4 結果

對疑似患病牛只采集樣品進行牛結節性皮膚病病毒核酸熒光PCR檢測，得到特異性擴增曲線，且CT值≤37，陰性對照無特異性擴增曲線。綜合臨床表現、病理特征以及熒光PCR檢測結果，確定患病牛只感染牛結節性皮膚病病毒。

5 措施及建議

一是檢測撲殺。對3個牛場調入牛逐頭采樣檢測，對所有發病和病原學陽性牛實施撲殺和無害化處理。二是封鎖隔離。對3個牛場實施封鎖30 d，嚴格禁止牛只移動[1]。同群病原學陰性牛嚴格進行隔離飼養，全場牛按山羊的5倍劑量緊急免疫接種山羊痘活疫苗。三是消毒處理。對全場飼養環境、圈舍、場地、器具、交通工具等進行嚴格徹底消毒。四是疫情報送。將陽性樣品送國家外來動物疫病研究中心復核確診，并向中國動物疫病預防控制中心報告疫情。同時，要求各級動物疫病預防控制機構對轄區內新引入牛只（奶牛、牧牛）開展排查摸底監測，并實行日報告制度。五是免疫接種。建議所有奶牛場（牧場）自行采購山羊痘活疫苗進行免疫接種。六是檢疫監管。要求各地強化調入牛只檢疫監管，重點對牛結節性皮膚病進行臨床癥狀的查驗和病原學監測[2-4]。七是宣傳培訓。強化動物疫情應急值守，密切關注疫情動態，加強宣傳培訓。