基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的“海藻-昆布”治療甲狀腺腫的作用機制研究

楊甫臣 張世超

遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院沈本醫(yī)院骨外科，遼寧本溪 110032

甲狀腺腫是指由多種原因引起的甲狀腺上皮細胞良性增生導致甲狀腺彌漫性或結(jié)節(jié)性腫大，是臨床上甲狀腺疾病中的常見病。近年來，隨著生活壓力不斷增大，其發(fā)病率不斷升高，且女性多于男性[1]。中藥治療甲狀腺疾病歷史悠久且具有很好的效果。《本草備要》[2]中記載：“海藻，瀉熱、軟堅痰、消癭瘤；昆布，功同海藻而少滑，性雄。治水腫癭瘤。”海藻歸肝、胃、腎經(jīng)，具有軟堅散結(jié)、消痰、利水的作用。昆布歸肝、胃、腎經(jīng)，具有同海藻同樣的功效。臨床上海藻、昆布兩味中藥常相互配伍加減，用于治療甲狀腺類疾病[3-5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門在多向藥理學理論和系統(tǒng)生物學理論基礎(chǔ)上分析藥物治療疾病的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，篩選相關(guān)的信號節(jié)點，推測藥物的成分、靶點蛋白、代謝通路等的學科[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學能全面系統(tǒng)地從多角度揭示藥物對疾病的作用機制[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，從成分、靶點、通路等多角度探討海藻、昆布治療甲狀腺腫的作用機制，為后續(xù)研究的開展提供新思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海藻、昆布化學成分及靶點的獲取

為了獲得海藻、昆布兩味中藥的化學成分，檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp），并以“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 以及半衰期（HL）≥4 h”作為篩選條件，選取同時滿足以上條件的作為其主要活性成分。TCMSP 數(shù)據(jù)庫包含了500 味中藥，中藥成分化合物總計30 069 個，并針對每個化合物提供了OB、DL、藥物HL 等性質(zhì)評價數(shù)據(jù)[8]。接著，檢索PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到其化學結(jié)構(gòu)以及Smiles 格式。同時通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）獲得主要活性成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一靶點蛋白的名稱，從而得到海藻、昆布兩味中藥的作用靶點。并將其結(jié)果上傳至Cytoscape 軟件，繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 中藥-甲狀腺腫相關(guān)靶點的搜集與篩選

為了獲得甲狀腺腫的相關(guān)疾病靶點，應(yīng)用Dis GeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、OMIM（http：//www.omim.org/）及GeneCards（http：//www.genecards.org/）3 個數(shù)據(jù)庫進行檢索，合并結(jié)果，去除假陽性和重復值，得到疾病相關(guān)靶點。將海藻、昆布成分作用靶點和甲狀腺腫相關(guān)的疾病靶點利用R 軟件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）進行映射構(gòu)建韋恩圖，篩選出中藥-疾病的共同靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點篩選

應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對上述篩選得到的共同靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，其中種類設(shè)為“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并下載保存TSV 格式文件。同時導入Cytoscape軟件中，基于Network Analyse 功能分析其網(wǎng)絡(luò)。并篩選節(jié)點度值（Degree）分布和介數(shù)中心性（Betweenness centrality）均在中位數(shù)以上的作為“核心靶點”。Degree和Betweenness centrality 是判斷網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的拓撲參數(shù)，其值與節(jié)點的重要性成正比。

1.4 GO-BP 生物功能注釋及KEGG 通路分析

利用Metascape 軟件（http：//metascape.org/，version 3.0）對上述得到的核心靶點進行GO-BP 生物功能和KEGG Pathway 富集分析，將研究物種設(shè)置為“Homo sapiens”，以此獲得海藻、昆布治療甲狀腺腫的生物學功能及KEGG 信號通路。將靶點基因、GO-BP 生物功能、KEGG 信號通路導入Cytoscape 軟件，繪制核心靶點-生物功能-信號通路圖。

2 結(jié)果

2.1 海藻-昆布主要活性化合物及靶點的篩選

通過在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選中藥的活性成分，共收集得到活性化合物海藻4 個、昆布6 個。將其Smiles 格式上傳到Swiss Target Prediction，篩選出作用靶點海藻225 個、昆布145 個。通過匯總兩味中藥的作用靶點并刪除重復值，最終得到兩味藥共有靶點305 個。應(yīng)用Cytoscape 軟件繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。

2.2 中藥與甲狀腺腫共同作用靶點

通過檢索DisGeNET、OMIM 及GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得1162 個甲狀腺腫的相關(guān)靶點。將305 個中藥的共有作用靶點與1162 個甲狀腺腫相關(guān)靶點輸入R軟件繪制韋恩圖，取交集后獲得中藥與疾病共同作用靶點70 個。見圖2。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心靶點分析

利用String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建上述共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中共有節(jié)點70 個，邊119 條。通過Cytoscape 軟件對網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點的拓撲參數(shù)（Degree和Betweenness centrality）進行分析篩選，即Degree≥4，Betweenness centrality≥3.30×10-3。共得到核心靶點25 個，包括磷脂酰肌醇3-激酶1（PIK3R1）、p53 基因（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）等。

圖2 中藥與疾病共同作用靶點韋恩圖

2.4 核心靶點生物功能富集分析與KEGG 通路分析

將篩選出的中藥-疾病核心靶點導入Metascape軟件分別進行GO-BP 生物學功能和KEGG 通路富集分析。結(jié)果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調(diào)控細胞蛋白定位、細胞有絲分裂周期的G1/S 轉(zhuǎn)變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學物質(zhì)的反應(yīng)及MAPK級聯(lián)和蛋白激酶B 信號傳導等生物學過程，以及p53、黏著斑、白細胞跨內(nèi)皮遷移、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發(fā)揮治療甲狀腺腫的作用。見圖4 和圖5。并通過Cytoscape 軟件構(gòu)建核心靶點-生物功能-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。

3 討論

中醫(yī)理論中并無甲狀腺腫疾病的概念，根據(jù)主要臨床特征，認為其屬于“癭病”范疇。《外科真詮》云：“癭瘤多外因六邪，營衛(wèi)氣血凝郁。”[9]中醫(yī)認為氣滯、痰凝、血瘀結(jié)于頸部是本病的基本病機，多采用理氣化痰、消癭散結(jié)的方法進行治療，如海藻玉壺湯、消瘰丸等，其方中均含有海藻、昆布兩味中藥。《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次提出應(yīng)用含碘中藥海藻用于治療本病，海藻中含有多糖、脂肪酸等多種活性成分，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次提出應(yīng)用其可治療癭病[10-11]。現(xiàn)代藥理學研究表明其具有抗菌抗炎、抗腫瘤和抗氧化的作用[12-13]。昆布主要活性成分昆布多糖、多酚、蛋白質(zhì)及纖維素等，具有調(diào)血脂、降血糖和血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學作用[14-16]。《嘉佑本草》中論述昆布的功效可以“去癭行水，下氣化痰”。目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，海藻、昆布加減治療甲狀腺結(jié)節(jié)具有很好的效果。

圖3 海藻-昆布治療甲狀腺腫的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 海藻-昆布治療甲狀腺腫的GO-BP 生物學功能

圖5 海藻-昆布治療甲狀腺腫的KEGG 信號通路

本研究篩選得到海藻活性成分包括二甘醇二苯甲酸酯、異巖藻糖甾醇、β-谷甾醇等；昆布活性成分包括24-亞甲基膽甾醇、花生四烯酸、巖藻甾醇等，并得到海藻作用靶點225 個、昆布145 個，與甲狀腺腫靶點取交集后得到共有靶點70 個。通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)以篩選得到25 個核心靶點，包括TP53、PIK3R1、AKT1、APP、TTR 等。p53 基因是一種細胞生長的重要調(diào)節(jié)因子，具有在DNA 復制水平上調(diào)節(jié)細胞正常生長的功能。沈育鋒等[17]研究發(fā)現(xiàn)，其在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫合并甲狀腺癌患者中的表達明顯增加，是一種特異性標志。PIK3R1、AKT1 是PI3K/AKT 信號通路的重要組成部分，具有調(diào)控細胞增殖與凋亡的作用，同時可以加速細胞周期，促進細胞增殖并抑制凋亡。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號通路在甲狀腺腫病變中異常激活[18-19]。APP 是一種淀粉樣蛋白前體蛋白基因，其與血清三碘甲腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）的表達密切相關(guān)，在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，血清T4水平升高，而T3水平下降[20]。而TTR 蛋白主要在肝臟中合成，具有轉(zhuǎn)運甲狀腺素的作用。

GO-BP 生物學功能富集分析結(jié)果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調(diào)控細胞蛋白定位、細胞有絲分裂周期的G1/S 轉(zhuǎn)變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學物質(zhì)的反應(yīng)以及MAPK 級聯(lián)和蛋白激酶B 信號傳導等生物學過程發(fā)揮作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，其主要通過p53、黏著斑、白細胞跨內(nèi)皮遷移、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發(fā)揮作用。已有研究表明，甲狀腺激素可通過激活p53、MAPK 等從而調(diào)控其下游基因表達[21]。VEGF信號通路可調(diào)節(jié)生理性及病理性血管生成過程，誘導內(nèi)皮細胞的增殖、分裂和遷移，促進新血管的生成，修復病變血管內(nèi)膜。VEGF 主要在甲狀腺濾泡細胞內(nèi)合成。目前多項研究表明，在甲狀腺腫患者的甲狀腺組織及血清中VEGF 均有較高水平的表達[22-24]。Jak-STAT 信號通路可調(diào)節(jié)細胞因子信號轉(zhuǎn)導，其主要參與介導人體缺氧、缺血以及氧化應(yīng)激等多種應(yīng)激反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，高甲狀腺激素可激活Jak-STAT 信號通路，從而進一步發(fā)揮其作用[25-26]。

圖6 海藻-昆布治療甲狀腺腫的核心靶點-GO-BP 生物功能-KEGG 信號通路互作網(wǎng)絡(luò)圖

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法初步闡明了海藻及昆布從多成分、多靶點、多通路治療甲狀腺腫的作用機制，為其今后研究提供思路和依據(jù)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)的局限性，后期仍需要相應(yīng)的實驗研究加以驗證。