基于網絡藥理學對四妙散治療高尿酸血癥主要活性成分及潛在靶點分析

葉文靜 林道斌 程亞偉 邱曉堂

廣州中醫藥大學附屬海南中醫院內分泌科，海南海口 570100

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）被廣泛認為是繼“三高”之后的第4 個重要的疾病危險因素[1]。據估計，我國沿海和經濟發達地區HUA 患病率在20%以上，已接近歐美發達國家水平。尿酸（UA）的升高，會導致痛風性關節炎、痛風腎病、心血管疾病的發生，并與肥胖、胰島素抵抗、高血壓發病等密切相關[2]。中藥具有作用多、靶點廣、副作用少的優點，在HUA 的治療中具有很高的研究應用價值。四妙散來源于清代張秉成的《成方便讀》，由黃柏、薏仁、蒼術、牛膝構成。現代中藥藥理研究表明，四妙散能夠抑制UA 合成酶XOD、XDH 活性，下調大鼠UA 轉運蛋白URAT1、GLUT9 表達，上調OAT1 表達而降低UA[3-4]。臨床治療方面，加味四妙散不僅能顯著降低UA，還能緩解全身癥狀，減少心血管事件發生[5-6]。目前對四妙散治療HUA 的作用機制研究大多是從單一成分或單一靶點進行的，這與多種成分、多個靶點的中藥治療本質背道而馳。因此本研究使用網絡藥理學的研究方法，對四妙散治療HUA 進行系統性探討，為四妙散治療HUA 提供理論基礎及方法依據。

1 資料與方法

1.1 四妙散有效成分收集與篩選

本研究以中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmspsearch.php）檢索關鍵詞“黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁”以獲得四妙散所有活性成分，并將篩選活性成分的條件設定為口服利用度（OB）≥30%和化合物類藥性（DL）≥0.18[7]。

1.2 藥物靶點的篩選與獲取

將藥物成分分子結構轉化為mol2 格式儲存，然后上傳至DRAR-CPI 數據庫（http://cpi.bio-x.cn/drar/）[8]。篩選靶點蛋白PDB ID，依據（Z-score）＜-1，最后導入Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/uniprot/P0A0N5）得到靶點蛋白對應基因。

1.3 獲取疾病靶點與交集靶點

通過GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/），獲取HUA 疾病靶點，并與“1.1”項下篩選出的藥物靶點進行韋恩分析，得到交集靶點。

1.4 活性成分-靶點網絡的建立

為進一步分析藥物作用的機制，本研究將四妙散有效成分及其作用的HUA 靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件建立網絡模型，得到活性成分-靶點關系圖，并依據網絡節點之間的連接數目進行分析。

1.5 四妙散治療HUA 的富集分析

將“1.3”項下獲取的交集靶點導入DAVID 工具（https://david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）、京都基因和基因組數據庫（KEGG）分析，并使用Rx64 3.6.2將GO 分析結果及KEGG 結果制成可視化圖和高級氣泡圖。

2 結果

2.1 四妙散有效成分及靶點信息的篩選結果

經TCMSP 平臺檢索，共獲得四妙散活性成分50 種，其中黃柏24 種、蒼術4 種、牛膝16 種、薏苡仁6 種，藥物靶點經DRAR-CPI 平臺共檢索到288 個，去重后有36 個。

2.2 疾病靶點及四妙散治療HUA 靶點的篩選結果

經GeneCards 數據庫檢索獲得471 個HUA 相關靶點，與TCMSP 平臺得到的藥物作用靶點進行韋恩分析，得到8 個治療HUA 的潛在靶點。見圖1。

2.3 活性成分-靶點相互作用網絡關系圖的構建

圖1 HUA 疾病靶點與藥物作用靶點韋恩分析圖

活性成分-靶點相互作用網絡關系圖中共有36 個節點，89 條邊。深色節點代表有效化合物，淺色節點代表潛在靶點。以度值（Degree）作為反映節點大小的依據，Degree 數值越大，節點越大。在活性成分方面，Degree 最高的活性成分分別為黃藤素（palmatine）10 個、豆甾醇（stigmasterol）9 個、小檗堿（berberine）8 個、黃連堿（coptisine）6 個、漢黃芩素（wogonin）6 個。在靶點方面，Degree 最高的靶點是前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、類視黃醇X 受體（RXR）、α 雌激素受體（ESR1）、內皮型一氧化氮合酶（NOS3），分別對應35 種、17 種、15 種、11 種藥物活性成分。見圖2。

2.4 四妙散治療HUA 的富集分析結果

GO 分析根據閾值P ＜0.05，錯誤發現率（FDR）＜0.01 確定了26 條GO 富集分析條目，其中生物過程有16 條，分子功能有7 條，細胞成分有3 條，見表1。同時根據FDR＜0.01 找到了11 條作用通路，見表2。表1、表2 分別列舉了FDR 最小的GO 和KEGG 通路分析結果。

為了使作用通路進一步可視化，制作了GO 分析條形圖（圖3，封四）和KEGG 分析氣泡圖（圖4，封四）。如圖3 所示，四妙散在生物過程中對鈣離子轉運的負調控、雌二醇的反應作用較大；在分子成分中，對細胞膜作用較大，在分子功能上，對酶結合的作用較大。如圖4 所示，cGMP-PKG 信號通路所在P 值最小，基因數最多，表明四妙散對此通路影響最大，而對脂肪細胞中脂解調節通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、小細胞肺癌通路、雌激素信號通路的影響次之。

3 討論

本研究發現了28 種四妙散治療HUA 的主要活性成分，Degree 最高的前兩種活性成分為黃藤素和豆甾醇。黃藤素主要成分為鹽酸巴馬汀，通過調節胰島素抵抗、抗氧化應激、抑菌消炎等生理功效發揮作用[9-10]。豆甾醇主要通過抗氧化、消炎、降脂、調節胰島素抵抗等發揮作用[11-13]。本研究推測黃藤素和豆甾醇可能通過降低胰島素抵抗、抗氧化應激、抑制炎癥、調節代謝紊亂等途徑對HUA 間接發揮效用。

圖2 活性成分-靶點相互作用網絡關系圖

圖3 活性成分靶點的GO分析條形圖(FDR<0.01)

圖4 四妙散治療HUA的靶點KEGG分析氣泡圖(FDR<0.01)

表1 活性成分靶點的GO 分析結果（FDR＜0.01）

表2 活性成分靶點的KEGG 分析結果（FDR＜0.01）

靶點方面，本研究發現了8 個治療HUA 的核心靶點，Degree 最高的靶點分別是PTGS2、RXRA、ESR1、NOS3。

前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）與PTGS2 合稱為環氧合酶（COX-1/2）。由于COX-1 在HUA 發病過程中鮮有報道，故研究集中在COX-2。COX-2 可誘導機體內毒素、細胞因子、炎癥介質等產生，并由內皮細胞、巨噬細胞及其他細胞釋放合成前列腺素（PG），進而產生發熱、疼痛和炎癥反應[14]。有研究顯示，UA 可通過血栓烷A2 引起血管平滑肌細胞增殖并上調其COX-2 mRNA 的表達，而選擇性的COX-2 抑制劑及血栓烷A2 拮抗劑可顯著降低UA[15]。此外，隨著UA 濃度的升高及代謝時間的延長，血管平滑肌細胞COX-2也隨之升高[16]。另有報道稱，沉積在關節中的尿酸鹽結晶能夠刺激COX-2 表達增加，尤其在痛風急性期，血清中COX-2 水平較慢性期明顯增高[17]。因此，四妙散可能通過作用于COX 靶點抑制炎癥反應，進而恢復UA 代謝平衡。

RXRA 與視黃酸受體（RAR）形成核受體家族[18]。RXR/RAR 的活化受視黃醇結合蛋白4 （RBP4） 的影響。由脂肪細胞分泌的RBP4 是一種小分子蛋白，主要在腎小管處重吸收[19]。高璐等[20]、Elizalde-Barrera 等[21]研究發現，HUA 患者血漿中RBP4 水平較不伴隨危險因素的高尿酸血癥患者顯著升高，血漿RBP4 與HUA 的發生中心環節主要是胰島素抵抗，胰島素抵抗會增加腎小管對鈉和UA 的重吸收，減少尿液中UA 的排泄，從而形成HUA。因此，四妙散作用于RXRA 靶點對改善胰島素抵抗，減少UA 排泄有積極作用。

雌激素受體是一種由ESR1 和β 雌激素受體（ESR2）調節的蛋白質分子。Zeng 等[22]發現雌二醇通過結合ESR2 在轉錄后期下調GLUT9 表達，減少UA的重吸收。相關研究顯示，絕經期女性UA 水平高于非絕經期婦女，而雌二醇較其長期居于較低水平，二者間呈負相關[23]。據此，本研究推測四妙散可能通過補充體內雌激素及作用于尿酸鹽轉運蛋白降低UA。

一氧化氮（NO）具有舒張血管、抑制白細胞黏附及血小板聚集等特性，在血管生成及神經系統中起著重要作用，而NOS3 是NO 合成途徑中的關鍵限速酶[24]。有研究發現在胰島素抵抗狀態下，細胞內活性氧大量增加，引發氧化應激反應，導致NO 失活，損害腎血管內皮細胞，影響Na+運動，抑制UA 排泄[25]。Serizawa 等[26]發現抑制一氧化氮合酶活性及NOS3 氧化磷酸化的偶聯被破壞，可減輕胰島素抵抗引起的內皮因子損傷。由此，說明四妙散作用于NO 靶點，可通過抑制炎癥反應、降低胰島素抵抗發揮作用。

此外，本研究還確定了11 條相關通路，如通路VEGF 是一種血管再生物質，可促進內皮細胞增殖、血管再生，改善腎缺血組織的側支循環及灌注，增加腎小球濾過率及UA 排泄[27-28]。雌激素信號通路異常通常與代謝性疾病的發生密切相關[29]。據報道，雌激素通過調節尿酸鹽轉運蛋白，或抑制XOD 系統，或通過減少肝臟脂肪堆積抑制戊糖磷酸途徑的活化，從而降低UA[30]。因此對相關通路的調控也是四妙散治療HUA 的關鍵步驟。