牛角膜渾濁和滲透性試驗(yàn)方法結(jié)合組織病理學(xué)對(duì)化妝品眼刺激性的預(yù)測(cè)價(jià)值

謝 珍 陳舒懷 劉 璐 何立成 朱社敏 匡榮

浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310052

日常生活中，人們的眼睛偶爾會(huì)暴露于化妝品，如沐浴露及染發(fā)類產(chǎn)品等。因此，化妝品引起的潛在眼刺激性的評(píng)估對(duì)于確保產(chǎn)品安全是至關(guān)重要的[1-2]。近年來(lái)，許多發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)立法，以禁止動(dòng)物試驗(yàn)并推廣替代技術(shù)。全球目前有近40 個(gè)國(guó)家/地區(qū)已經(jīng)正式實(shí)施了化妝品動(dòng)物試驗(yàn)禁令，還有數(shù)十個(gè)國(guó)家正在立法的過(guò)程中，這些法規(guī)的變化對(duì)全球化妝品的產(chǎn)品研發(fā)、安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、立法監(jiān)督和國(guó)際貿(mào)易均產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[3-5]。而國(guó)內(nèi)的化妝品安全性評(píng)價(jià)法規(guī)還是依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，依據(jù)2015 版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[6]中“急性眼刺激性/腐蝕性”項(xiàng)下規(guī)定，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室多年的化妝品檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應(yīng)等級(jí)多為無(wú)刺激性、微刺激性至輕刺激性，加之傳統(tǒng)的Draize 試驗(yàn)存在較多缺陷[7]，有必要尋找合適的體外測(cè)試方法。

牛角膜渾濁和滲透性（bovine corneal opacity and permeability，BCOP）試驗(yàn)是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）認(rèn)可的眼刺激試驗(yàn)的替代方法之一，可對(duì)無(wú)刺激性（不分類）和嚴(yán)重刺激性（1 類）的物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確分類[8]，但對(duì)弱到中等刺激程度（2B 和2A 類）的樣品不能完全準(zhǔn)確判斷[9]。到目前為止，沒(méi)有單一的體外替代方法能夠完全代替Draize 試驗(yàn)[10]。角膜的組織病理學(xué)評(píng)估可作為BCOP 測(cè)試的附加參數(shù)，提供病變類型和損傷深度這些重要的補(bǔ)充信息[11]。盡管OECD TG 437[12]中尚未將角膜的組織病理學(xué)評(píng)估納入其中，但OECD 已發(fā)布了相關(guān)指導(dǎo)文件以促進(jìn)這一評(píng)估的應(yīng)用[13]。已有學(xué)者[14]將其與牛角膜的組織學(xué)觀察相結(jié)合建立預(yù)測(cè)模型，包括上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮3 層結(jié)構(gòu)，來(lái)對(duì)化學(xué)品的眼刺激性進(jìn)行評(píng)估。本研究將BCOP 測(cè)得的結(jié)果與每種受試物對(duì)應(yīng)的角膜上皮的相應(yīng)組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行比較，包括市售的沐浴露及染發(fā)劑，將角膜上皮的病變損傷分級(jí)與體外刺激評(píng)分值（IVIS）及Draize試驗(yàn)的體內(nèi)數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立化妝品眼刺激性的預(yù)測(cè)模型，為化妝品的安全評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛眼球 牛眼球來(lái)源于浙江省富陽(yáng)市九鮮肉牛定點(diǎn)屠宰場(chǎng)。試驗(yàn)前日晚由屠宰場(chǎng)受訓(xùn)人員于牛死亡后立即摘除眼球放入HBSS 溶液中，置運(yùn)輸冷藏箱中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)新西蘭家兔，購(gòu)于浙江省桐鄉(xiāng)市銀海牧業(yè)專業(yè)合作社，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.1907170115，體重：1.9～2.6 kg，雌雄皆用。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2016-0009。動(dòng)物飼料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：蘇飼證（2019）01008。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前在動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境至少3 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.3 試劑與儀器 MEM 培養(yǎng)液（2053121）、MEM 培養(yǎng)液（含酚紅，2048092）、HBSS 緩沖液（1897082）購(gòu)于美國(guó)gibco 公司；熒光素鈉（20170426）、無(wú)水乙醇（20190618）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CTHI-150B 型恒溫恒濕箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；OPACITOMETER 混濁度儀（德國(guó)DURATEC Analysentechnik GmbH）；MAX190 型紫外可見(jiàn)連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices Corporation）。ST5010 自動(dòng)載玻片染色機(jī)、EG1150 包埋機(jī)、HI1220 烘片機(jī)、RM2235 切片機(jī)、DM4000BLED 顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 Draize 試驗(yàn)法 參照2015 版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[6]“急性眼刺激性/腐蝕性”項(xiàng)下所示方法。每個(gè)樣品取沒(méi)有眼病的健康家兔3 只，染發(fā)劑類（#1、#2、#3、#4、#5）樣品按說(shuō)明書進(jìn)行配制，沐浴露類（#1、#2、#3、#4）樣品使用原液，將0.1 mL 的樣品加入一側(cè)結(jié)膜囊中，眼閉合1 s，至第4 秒（染發(fā)劑類）/第30 秒（沐浴露類）時(shí)用足量、流速較快但又不會(huì)引起動(dòng)物眼損傷的水流沖洗30 s，另側(cè)眼睛不處理作自身對(duì)照，按要求對(duì)動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查并判定受試物對(duì)眼的刺激強(qiáng)度。

1.2.2 BCOP 試驗(yàn)法 試驗(yàn)方法按照OECD TG 437[12]，將分離的角膜安裝在角膜固定器中，平衡后測(cè)量初始濁度值，每個(gè)樣品平行3 個(gè)角膜，陰性對(duì)照為純化水，陽(yáng)性對(duì)照為無(wú)水乙醇。分組后將角膜暴露于受試物中，染發(fā)類產(chǎn)品依據(jù)樣品說(shuō)明書現(xiàn)配現(xiàn)用，其余受試物使用原液。孵育結(jié)束后讀取終末濁度值。加入熒光素鈉溶液孵育后在490 nm 波長(zhǎng)處讀取后室液體的吸光度值并計(jì)算IVIS。IVIS≤3，無(wú)刺激性（GSH 不分類）；3＜IVIS≤55，輕微到中等刺激（GSH 為2A 或2B 類）；IVIS＞55，嚴(yán)重刺激（GSH 為1 類）。

1.2.3 組織制片及分析方法 測(cè)試結(jié)束后取下角膜，置于10%的中性福爾馬林溶液中固定，取材部位為角膜中間區(qū)域，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，角膜橫切面進(jìn)行切片，厚度4 μm，使用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，用光學(xué)顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞，基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的組織病理學(xué)變化并拍照。角膜上皮的病變分級(jí)評(píng)分（H）標(biāo)準(zhǔn)如下：0 表示不值得注意；1 表示輕微；2 表示輕度；3 表示中度；4 表示嚴(yán)重。刺激分級(jí)根據(jù)角膜的病變部位：鱗狀細(xì)胞（輕微），鱗狀細(xì)胞至上翼狀細(xì)胞（輕度），鱗狀細(xì)胞至翼狀細(xì)胞下層（中度），基底細(xì)胞（嚴(yán)重）。

2 結(jié)果

2.1 受試物眼刺激性試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)，眼刺激性檢驗(yàn)結(jié)果均合格，BCOP結(jié)合H 分類結(jié)果與Draize 試驗(yàn)結(jié)果一致。見(jiàn)表1。

表1 受試物眼刺激性結(jié)果（n=3）

2.2 角膜組織病理學(xué)變化

暴露于不同受試物的角膜的具體組織學(xué)變化情況見(jiàn)圖1。（1）陰性對(duì)照：角膜3 層結(jié)構(gòu)完整，最外層細(xì)胞由于生命周期的原因可見(jiàn)輕微脫落,H 值為0，見(jiàn)圖1A。（2）陽(yáng)性對(duì)照：上皮表層鱗狀細(xì)胞凝固，翼狀細(xì)胞和基底細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核空泡化，在基質(zhì)的上半部分觀察到松散的膠原束和角膜細(xì)胞的腫脹，內(nèi)皮完整，H 為4 分，見(jiàn)圖1B。（3）組織病理學(xué)評(píng)分較低（輕微），病變僅限于鱗狀細(xì)胞層，H 值為1：①沐浴露#1：最外層的鱗狀細(xì)胞可見(jiàn)輕微腫脹和脫落。其余未見(jiàn)明顯病理變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1C。②沐浴露#4：鱗狀細(xì)胞表現(xiàn)出連續(xù)的水腫及腫脹，可觀察到細(xì)胞核融合及腫脹。內(nèi)部鱗狀細(xì)胞層未顯示出明顯的病理變化，維持了角膜上皮的分層結(jié)構(gòu)。角膜基質(zhì)無(wú)變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1D。③染發(fā)劑#1：最外層的鱗狀細(xì)胞可見(jiàn)輕微脫落。其余未見(jiàn)明顯病理變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1E。（4）組織病理學(xué)評(píng)分仍較低（輕度），且病變局限于鱗狀細(xì)胞和上翼狀細(xì)胞層，H值為2：①沐浴露#3：鱗狀細(xì)胞層部分缺失，細(xì)胞質(zhì)的空泡化延伸至翼狀細(xì)胞層表層細(xì)胞。角膜基質(zhì)無(wú)變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1F。②染發(fā)劑#4：鱗狀細(xì)胞呈圓形或橢圓形。在上翼狀細(xì)胞層中可觀察到細(xì)胞質(zhì)的空泡化。與病變部位直接接觸的翼狀細(xì)胞表現(xiàn)出核凝結(jié)。其余未觀察到明顯變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1G。③染發(fā)劑#5：鱗狀細(xì)胞層完全缺失，在上翼狀細(xì)胞層中可觀察到細(xì)胞腫脹。其余未觀察到明顯變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1H。（5）組織病理學(xué)評(píng)分為中度，病變位于鱗狀細(xì)胞層至上、下翼狀細(xì)胞層，或嚴(yán)重至延伸到基底細(xì)胞，H 值為3 或4：①染發(fā)劑#2：整個(gè)鱗狀細(xì)胞層及表層翼狀細(xì)胞缺失，其余翼狀細(xì)胞可見(jiàn)顯著的細(xì)胞質(zhì)空泡化。基底細(xì)胞保持完整。角膜基質(zhì)無(wú)變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1I。②沐浴露#2：鱗狀和上翼狀細(xì)胞層缺失，深層翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞仍存在，在向基底細(xì)胞過(guò)渡區(qū)域的翼狀細(xì)胞周圍存在小空泡。角膜基質(zhì)無(wú)變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1J。③染發(fā)劑#3：整個(gè)鱗狀細(xì)胞層缺失及剩余細(xì)胞之間的粘附喪失，連接斷裂。上翼狀細(xì)胞層腫脹明顯，呈圓形或橢圓形，深層翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞仍存在，均顯示出更廣泛的細(xì)胞質(zhì)空泡化和腫脹（細(xì)胞之間空隙清晰）。角膜基質(zhì)無(wú)變化。內(nèi)皮完整，見(jiàn)圖1K。

圖1 角膜組織病理學(xué)變化（HE 染色）

2.3 BCOP 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)變化預(yù)測(cè)化妝品眼刺激性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)表1 和圖1，建立IVIS 結(jié)合角膜上皮病變?cè)u(píng)分的眼刺激性等級(jí)的預(yù)測(cè)模型，見(jiàn)表2。如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無(wú)刺激性；如果IVIS≤6，且H≤1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質(zhì)及內(nèi)皮無(wú)異常，則判定為輕刺激性。

表2 BCOP 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)變化預(yù)測(cè)化妝品眼刺激性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

BCOP 測(cè)試由渾濁度和熒光素鈉通透性這兩個(gè)主要終點(diǎn)組成，來(lái)間接量化由測(cè)試物質(zhì)引起的對(duì)角膜的損傷。渾濁度受角膜上皮蛋白質(zhì)的沉淀或變性的影響。角膜上皮由從前到后由3 層組成：鱗狀細(xì)胞層、翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞層，上皮細(xì)胞起源于基底細(xì)胞并分化成為翼細(xì)胞，然后分化成鱗狀細(xì)胞。角膜上皮在成人中大約每7 天會(huì)更新?lián)Q代1 次。眼部創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞有絲分裂活躍[15-17]。此外，上皮細(xì)胞具有細(xì)胞間連接，例如緊密連接和黏附連接，其中緊密連接是角膜最頂端的結(jié)構(gòu)，可消除細(xì)胞間隙以提供滲透性屏障。細(xì)胞間連接的破壞，如上皮層細(xì)胞變性、壞死或缺失，會(huì)增加上皮的通透性，進(jìn)而顯著影響物質(zhì)的眼刺激性潛力[18]。同時(shí)，物質(zhì)對(duì)角膜上皮的細(xì)胞毒性是其作用的重要方式[19]，加之BCOP 方法對(duì)弱到中等刺激程度的樣品不能準(zhǔn)確判斷。作為BCOP 測(cè)定的補(bǔ)充參數(shù)，病理組織學(xué)分析可確定角膜病變的深度及程度[20]。因此，角膜上皮的組織病理學(xué)評(píng)估可為眼刺激性分類提供更可靠的依據(jù)。

文中展示了9 種市售沐浴露和染發(fā)劑在BCOP測(cè)定中所觀察到的組織病理學(xué)特征，結(jié)果顯示組織，病理學(xué)結(jié)果與測(cè)試物質(zhì)的IVIS 相當(dāng)。IVIS 越大，物質(zhì)損傷角膜的深度越深，組織學(xué)評(píng)分的分值越大[21]，提示角膜上皮的組織病理學(xué)特征為化妝品體外眼刺激性分類為無(wú)刺激性至輕刺激性提供更好的佐證。依據(jù)受試物的IVIS、角膜上皮組織學(xué)特征及Draize 試驗(yàn)結(jié)果，本文建立了IVIS 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)的預(yù)測(cè)模型來(lái)評(píng)估化妝品的眼刺激性，本研究將微刺激性和輕刺激性的IVIS 臨界值定為6，這與已有的文獻(xiàn)報(bào)道[22]一致，認(rèn)為IVIS≤6 的物質(zhì)引起的組織病理學(xué)變化僅限于鱗狀細(xì)胞層，且可迅速恢復(fù)。此外，即如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無(wú)刺激性；如果IVIS≤6，且H=1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質(zhì)及內(nèi)皮無(wú)異常，則判定為輕刺激性。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室多年的化妝品檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應(yīng)等級(jí)多為無(wú)刺激性、微刺激性至輕刺激性，極少為中刺激性，未見(jiàn)腐蝕性[23]，依據(jù)文中9 種受試物的有限數(shù)據(jù)，該預(yù)測(cè)模型目前未把中刺激性和腐蝕性納入其中，雖尚未覆蓋全部刺激譜，但可將微刺激性和輕刺激性進(jìn)行區(qū)分，滿足日常化妝品眼刺激性的評(píng)估工作。總之，結(jié)合角膜上皮組織病理學(xué)評(píng)分的BCOP 法可作為微刺激性或輕刺激性分類的依據(jù)，適用于化妝品眼刺激性的檢測(cè)。