2-羥基戊二酸在異檸檬酸脫氫酶突變型膠質瘤發生、發展中的作用及磁共振波譜檢測方法

葛 穎，俞梅美，沈慧聰*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院放射科，北京 100070；2.北京市回民醫院放射科，北京 100054)

經年齡校正后，2012—2016年美國中樞神經系統腫瘤平均年發病率為23.41/100 000，其中惡性者約占30.2%，以膠質瘤最多見[1]。WHO依據組織病理學及臨床診斷標準將中樞神經系統腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ級。隨著基因組測序技術的發展，2016年WHO將分子表型引入中樞神經系統腫瘤分類，基于異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)將彌漫性膠質瘤分為IDH突變型、IDH野生型及非特異型[2]，約80%～90%的Ⅱ、Ⅲ級膠質瘤及多數繼發性膠質母細胞瘤腫瘤組織中存在IDH突變[3]。2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)為IDH突變型膠質瘤的特征性代謝產物，通過競爭性抑制α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)依賴的雙加氧酶，多方面影響腫瘤發生、發展及侵襲過程。磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)為無創性檢測2-HG的影像學方法。本文對2-HG在IDH突變型膠質瘤發生、發展中的作用及MRS檢測2-HG方法進展進行綜述。

1 IDH突變與2-HG

IDH(包括IDH1、IDH2及IDH3)為小分子蛋白，是體內具有脫羧作用的氧化還原酶，催化三羧酸循環中異檸檬酸氧化脫羧生成α-KG，并在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的過程中起重要作用。生物體內的IDH包括NADP依賴型(IDH1、IDH2)及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型(IDH3)2種存在形式。IDH1存在于胞質及過氧化物酶體中，除維持生物體抗氧化系統外，還可促進脂質合成；IDH2存在于線粒體中，主要參與細胞能量代謝；腦膠質瘤尚未發現存在IDH3。IDH突變發生于神經膠質細胞自干細胞分化為星形膠質細胞和少突膠質細胞的早期。IDH1/2突變時，其功能及代謝產物將會發生改變；突變的IDH催化異檸檬酸代謝生成2-HG[4]。

2 2-HG與IDH突變型膠質瘤

2-HG包括D-2-HG及L-2-HG，前者僅由突變的IDH催化生成。2-HG與α-KG為對映體，是α-KG依賴的雙加氧酶的競爭性抑制劑。人體中存在60余種依賴α-KG的雙加氧酶，且與多種途徑有關，涉及膠原、組蛋白、轉錄因子、烷基化脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、脂質、抗生素、基因組中DNA的5-甲基胞嘧啶及RNA的6-甲基腺嘌呤。2-HG對α-KG依賴的雙加氧酶的競爭性抑制影響多條細胞通路[5]。2-HG水平對于診斷IDH突變及預測患者預后、評估復發具有重要意義[4,6]。

2.1 膠質瘤發生 2-HG通過阻止干細胞分化、抑制抑癌基因活性、降低DNA修復速率及逃避宿主免疫系統對腫瘤攻擊的方式而影響IDH突變型腦膠質瘤的發生。2-HG競爭性抑制Jmj-C結構域組蛋白去甲基化酶，使組蛋白3賴氨酸甲基化水平明顯升高，可阻止干細胞正常分化[4]；同時，2-HG可競爭性抑制α-KG依賴的DNA甲基轉移酶催化活性，阻止DNA去甲基化，致DNA高甲基化廣泛存在；2-HG還競爭性抑制10-11位轉位蛋白雙加氧酶活性，致DNA去甲基反應中介體——5-羥甲基胞嘧啶減少。以上3條通路使CpG島高甲基化表型廣泛存在于分化受阻的干細胞中，可致抑癌基因失活[7]。另一方面，2-HG競爭性抑制烷烴羥化酶家族蛋白氧化去甲基酶活性，使細胞中DNA的修復速率下降而加重DNA損傷[8]，誘導腫瘤發生。最近研究[9]表明，2-HG可抑制補體激活途徑，抑制腦膠質瘤組織標本中腫瘤性T細胞的增殖、吞噬和細胞因子的分泌，有助于腫瘤逃避宿主免疫系統的攻擊。

2.2 膠質瘤發展 機體中還存在其他依賴α-KG的雙加氧酶，如含脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，PHD)的結構域蛋白及膠原蛋白脯氨酰4-羥化酶(collagen prolyl 4-hydroxylase，C-P4H)。正常氧含量環境下，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)亞基被PHD(PHD1、PHD2、PHD3)羥基化，進而被希佩爾-林道(von Hippel-Lindau)蛋白識別、泛素化，最后被蛋白酶降解。2-HG競爭性抑制PHD，尤其是PHD2時，HIF-1α上調，促進正常星形膠質細胞增殖，誘導血管內皮生長因子及促紅細胞生成物表達，促進腫瘤血管形成及葡萄糖代謝，進而影響對腫瘤生長至關重要的其他信號通路[6]。SEMUKUNZI等[10]認為D-2-HG的產生可刺激PHD2介導的HIF-1α降解，而在某些IDH突變細胞類型中出現的PHD抑制可能是某種間接影響的結果。L-2-HG在缺氧條件下積聚亦非IDH介導，故2-HG對HIF-1α的影響尚有爭議[11]。

2-HG競爭性抑制膠原蛋白-脯氨酰羥化酶，使Ⅳ型膠原螺旋結構形成障礙，羥脯氨酸、羥賴氨酸介導的膠原蛋白修飾被破壞，致Ⅳ型膠原成熟障礙，破壞基底膜，觸發內質網應激反應[4,12]；而基底膜異常在腦膠質瘤的發展中起著重要作用[13]。

3 MRS檢測2-HG

免疫組織化學及基因組序列分析是檢測IDH突變的金標準。檢測2-HG的傳統方法包括液相色譜-質譜法和利用同位素標記戊二酸作為內參、氣相色譜-質譜聯用法，僅能測定甲醛溶液固定后石蠟包埋樣本中的2-HG水平[6,14]。無創獲取腫瘤性質信息具有重要臨床意義[15]。諸多影像學方法中，MRS被認為是非侵入性檢測2-HG水平的理想方法[16]。臨床應用中，2-HG譜峰與具有類似結構的谷氨酸(glutamic acid，Glu)及谷氨酰胺(glutamine，Gln)譜峰存在大量重疊，使得如何分離2-HG特征性譜峰成為MRS檢測2-HG的最大挑戰。

3.11H-MRS檢測2-HG

3.1.1 掃描場強 MRS掃描常用場強為3.0T。MEKLE等[17]發現7.0T較3.0T具有更高的光譜分辨率及更好的信噪比(signal noise ratio，SNR)。9.4T場強下，光譜分辨率進一步提高，可觀察到腫瘤代謝產物2-HG以及α-KG減少導致的代償性Glu及Gln峰值減低和NADPH消耗所致谷胱甘肽峰減低。但高場強也存在局限性，如化學位移偏差、場強不均勻及短重復時間(repetition time，TR)引起的T1污染對代謝物質定量測量的影響等[18]。

3.1.2 掃描序列 點解析波譜(point-resolved spectroscopy，PRESS)是MRS最常用序列，該序列顯示位于2.25 ppm的譜峰具有良好的準確率及SNR[12]。但BRANZOLI等[19]認為 PRESS序列生成的波譜圖像中位于2.25 ppm的2-HG峰仍部分與其他代謝產物譜峰重疊，而Meshcher-Garwood點分辨光譜法(Meshcher-Garwood point resolved spectroscopy，MEGA-PRESS)序列波譜圖像中位于4.02 ppm的2-HG譜峰去除了其他代謝產物的影響，可更準確地定量2-HG水平，且更適用于檢測靶向治療過程中2-HG水平變化；雖然MEGA-PRESS序列的SNR低于PRESS，以MEGA-絕熱式選擇性重聚波譜替代MEGA-PRESS可有效加以彌補。對于單體素波譜(single-voxel spectroscopy，SVS)或多體素化學位移成像(chemical shift imaging，CSI)采樣體素定位，ZHOU等[20]認為SVS對術前診斷IDH突變型膠質瘤價值更高，而CSI在鑒別IDH突變型膠質瘤復發中表現更好。

3.1.3 掃描參數 SASAKI等[12]發現回波時間(echo time，TE)影響檢測2-HG的敏感度及特異度。俞梅美等[21]在3.0T場強下應用PRESS序列對比TE=35 ms(TE1=21 ms，TE2=14 ms)及TE=97 ms(TE1=32 ms，TE2=65 ms)的檢測效率，結果顯示TE=97 ms更有利于定位體素，且在2.25 ppm處可更清晰地顯示窄2-HG峰，以與鄰近的Glu、Gln及γ-氨基丁酸峰區別。CHOI等[22]認為以較短TE、較長TR可獲得完整的代謝物信號，更適用于精確地定量測量2-HG水平。

3.1.4 體素范圍 檢測2-HG的敏感度在很大程度上依賴于體素范圍，體素為8 ml是MRS分辨率的下限[23]。既往研究[14]發現測量腫瘤內小范圍體素的敏感度較全體素均值更高，但這也是術后復查MRS時選擇體素的主要難點。選擇體素時原則上應包括腫瘤范圍，并使部分容積效應最小化，2 cm×2 cm×2 cm為最常用體素范圍。

3.1.5 圖像處理 常用于定量分析2-HG的譜峰編輯軟件包均基于基譜擬合法，包括LCModel、QUEST及AQSES，區別在于對背景，即未知代謝物及大分子參數的估計方法不同。LCModel基于預先定義大分子及脂質的基組，臨床最為常用[12]；QUEST假設背景包含快速衰減成分，并允許極端點；AQSES則利用反傅里葉轉換樣條基組，通過擴展代謝物基譜，即將大分子納入基組而建模[24]。此外，LCModel于頻域上執行擬合，而QUEST及AQSES則在時域上執行擬合。WENGER等[24]認為確定擬合域(時域或頻域)和基線矯正是影響2-HG譜峰編輯的重要因素。

3.1.6 判讀結果 多以2.25 ppm處的2-HG絕對濃度作為診斷IDH突變參考值，范圍0.897～2.000 mmol/L，也有學者[12]推薦以1.76 mmol/L作為最佳參考值。SUH等[14]推薦，TE=97 ms單體素PRESS序列下，2-HG閾值為1 mmol/L。另有研究[14,25]認為，基于水濃度在正常腦組織、腫瘤組織及不同類型腫瘤組織中恒定的假設測量2-HG絕對濃度因無法去除水腫嚴重程度、腫瘤細胞及組織學類型、腫瘤組織正確分割等混雜因素而與真實值有所差異，引入內源性肌酸(creatine，Cr)很好地解決了上述問題，并推薦SVS序列中2-HG/Cr閾值為0.11，CSI序列中2-HG/Cr閾值為0.23。鑒于IDH突變除2-HG外還帶來其他代謝產物變化，以2-HG結合其他代謝產物作為診斷IDH突變的生物學指標具有一定臨床意義。俞梅美等[21,26]認為TE=97/93 ms單體素PRESS序列總2-HG水平升高，結合Glu水平下降作為診斷標準較僅以2-HG水平作為診斷標準的敏感度更高，并推薦以2-HG>1.8 mmol/L或Glu<3.9 mmol/L作為診斷IDH突變的標準。

除技術因素影響2-HG檢出率外，SUH等[27]發現瘤體本身因素亦可影響2-HG檢出，如壞死超過20%及表觀彌散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)較低與2-HG假陽性有關，原因在于壞死區內含脂質，部分于2.0～2.9 ppm產生共振，可能增加2-HG測量點的信號；而ADC較低與2-HG假陽性相關的原因有待進一步探討。

3.213C-MRS檢測2-HG 除1H-MRS外，PICHUMANI等[28]認為在組織活檢和腫瘤提取物13C-MRS的基礎上輸注富含13C標記的底物分析腫瘤代謝可能是具有潛力的方法。采用低溫冷卻后的13C探針可顯著提高檢出2-HG譜峰的敏感度。另有研究[28]發現利用三維功能光譜圖動態定量測量2-HG可監測IDH突變型膠質瘤患者對于治療的反應。

總之，2-HG富集是IDH突變型膠質瘤最有特征性的代謝改變，且在腫瘤發生、發展及侵襲過程中具有重要作用。作為無創性檢測2-HG的影像學方法，MRS在IDH突變型膠質瘤的診斷、判斷預后及評估復發等方面具有一定臨床價值。但目前MRS尚缺乏規范的掃描方案，通過改進場強、掃描序列、TE及選擇頻譜編輯方法等和優化判讀指標，可改善MRS對2-HG譜峰的顯示能力，拓展其臨床應用范圍。