高通量測序技術在新生兒疾病篩查中的應用進展

吳 爽，強 榮，張瑞雪，華 偉

(1.西安醫學院，陜西 西安 710000；2.西北婦女兒童醫院醫學遺傳科，陜西 西安 710061)

新生兒疾病篩查(newborn screening，NBS)是一項成功的公共衛生項目，是指在新生兒期對嚴重危害新生兒健康的先天性、遺傳性疾病施行專項檢查，在出現癥狀之前提供早期診斷和治療，從而改善臨床結果[1]。1963年，Guthrie和Susi[2]首次報道了細菌抑制試驗篩查苯丙 酮尿癥(phenylketonuria，PKU)，開啟了新生兒篩查的序幕。隨之，酶活性測定半乳糖血癥、放射性免疫法篩查先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)均獲得成功，至此以PKU和CH為主的NBS在歐美發達地區迅速開展。到20世紀90年代，串聯質譜技術的出現使NBS發生了革命性的轉變，它可以通過一次實驗篩查多種疾病，大大擴展了篩查病種[3]。如今，NBS已在國際上廣泛推廣，是國際公認的降低新生兒疾病發病率及死亡率的重要措施。

目前，NBS篩查方法主要包括質譜技術、免疫學方法、酶學、高壓液相色譜及電泳等。通過檢測生化指標發現新生兒體內異常的代謝改變，進而實現疾病的早期診斷。除CH外，現階段的NBS篩查病種均屬于遺傳性疾病。據統計，活產新生兒中不同種類遺傳性疾病占3%～5%[4]，使這些患兒面臨早期死亡或致殘。某些疾病，如PKU，早期干預可明顯改善預后，因而盡快明確診斷尤為重要。但是目前篩查技術存在篩查病種有限，漏檢，并可能存在假陰性及假陽性等缺點，還不能完全滿足臨床需求。隨著分子生物學的發展，DNA測序技術為NBS開辟了新的途徑。高通量測序技術(next-generation sequencing，NGS)也稱下一代測序技術，相較于傳統的一代測序技術，它以成本低、通量高、速度快的特點在優生遺傳領域得到了廣泛的應用，其主要包括：遺傳病的診斷、攜帶者篩查、植入前遺傳學檢測、臨床用藥指導等。NGS按照測序覆蓋范圍大小大致分為：全基因組測序、全外顯子組測序、靶向目標基因測序。該技術通過一次性檢測數百至數千種基因變異，實現在分子水平對遺傳性疾病的精準診療。在新生兒領域，NGS技術已作為新生兒遺傳性疾病確診的重要依據。近年來，該技術在NBS方面的應用處于探索中，現對NGS在NBS方面的研究進展進行綜述。

1高通量測序技術作為二級NBS手段的應用

目前大部分NBS的模式是將NGS作為二級篩查手段，即對生化篩查陽性患兒或疑似患兒進行測序，以明確診斷、治療指導和預后評估[5]。該種篩查模式在一些疾病中運用較為成熟，如遺傳代謝病(inherited metabolic disorders，IMD)、嚴重聯合免疫缺陷病、囊性纖維化等。以IMD為例，串聯質譜技術目前在新生兒IMD的篩查中已得到廣泛應用，它可以在短時間內對1個樣本進行幾十種代謝產物的分析，具有高靈敏性和特異性及快速、成本低的優勢。由于IMD沒有特定的臨床表現，且質譜檢測病種有限，同時涉及多個指標和比率，臨床較難判斷。如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥質譜指標均為C3及C3/C2。更有許多IMD存在亞型，并且不同亞型治療方案均有不同。因此，對質譜后出現可疑陽性結果的患兒進行準確診斷非常重要，NGS能夠同時對多種基因進行突變分析，成為現階段遺傳代謝病診斷的重要手段。有研究對1 033例質譜陽性患兒進行NGS，共診斷出各類遺傳代謝病194例，NGS均確定了疾病類型。鑒定出23種IMD，包括10種氨基酸代謝異常(43.5%)、8種有機酸缺陷病和5種脂肪酸氧化缺陷病[6]。另外，串聯質譜結果反映的是體內代謝物的異常，會受到嬰兒出生時的孕周、輸血情況、年齡等混雜因素的限制，NGS可以在分子層面提供明確診斷，以彌補質譜技術的不足[7]。由于質譜技術容易受環境因素的影響，無法區分受影響的患者及雜合攜帶狀態。有研究表明，NGS在解釋NBS中代謝物濃度異常方面很有價值，它可以區分此種情況，并可減少診斷的時間[8]。

但迄今為止，與質譜技術的方法相比，基因檢測較質譜技術費用高，檢測周期長，并且會帶來龐大的數據分析和難以解讀臨床意義的不明變異，會給臨床實驗室帶來很大的挑戰。有研究對102例疑似IMD患兒進行了NGS，當生化實驗提示某種單基因病或特定的IMD時，NGS可以確診59%(39/66)的患兒，而當懷疑IMD但無臨床表型及生化特異性時，只有8%(3/36)的患兒通過NGS得到了診斷[9]。這說明了生化檢查和臨床表型在指導NGS數據分析中的作用。由美國國立衛生研究院(national institutes of health，NIH)資助的基因組醫學和公共衛生的新生兒測序(newborn sequencing in genomic medicine and public health，NSIHT)聯盟成立于2014年。NBseq計劃是NSIHT項目之一，它在182個經生化檢測確診IMD的患兒樣本中，發現DNA測序遺漏了約20%確診病例，這些病例都是非常罕見的疾病，其中一些可能是由于DNA重組或調節基因活性的區域發生突變，外顯子測序無法檢測，使用全基因組測序又較為昂貴，并且結果解讀更具有挑戰性[10]。最近一項研究顯示，全外顯子測序技術(whole exome sequencing，WES)對于IMD的敏感性為88%，特異性為98.4%，而串聯質譜技術分別為99.0%和99.8%[11]，表明現階段NGS并不適合代替生化檢查作為一級的遺傳代謝病篩查方法。因此，將NGS技術應用到NBS中仍然是作為生化檢測結果陽性后的二級篩查方法。綜上所述，NGS和質譜技術對IMD的篩查各有利弊，需要優勢互補，才能發揮在臨床上的最大價值。

2高通量測序技術作為一級NBS手段的應用

隨著NGS成本的下降和基因數據庫的更新完善，人們開始考慮如何更大規模地應用DNA測序，并擴展篩查病種，以更早地發現由于基因缺陷而導致的新生兒健康問題，以及如何利用分子生物學改善兒童的臨床結局。

2.1高通量測序技術應用于高危新生兒疾病的篩查

任何一項技術運用于臨床中都是循序漸進的過程。在新生兒重癥監護室(neonatal intensive care unit，NICU)中，遺傳性疾病和先天異常是導致患兒死亡的主要原因，將NGS運用于NICU中患兒的篩查是人們考慮進行廣泛NGS的第一步。對于危重患兒，得到準確診斷關乎生死，并可以縮短住院時間，改善臨床結局。Meng等[12]對278名小于100天的NICU嬰兒進行WES測序，總體診斷率為36.7%(102/278)，改善臨床結果52.0%(53/102)；另一項研究對25名NICU患兒行WES，診斷率為60%，改善臨床結果83%[13]，說明NGS測序是一種強大的工具，其使用對臨床決策有顯著影響。除此之外，NICU中的早產兒會因為器官系統不成熟，如肝臟酶活性較低、長期腸外營養需求等，會使NBS出現假陽性結果，需要反復進行NBS和額外的后續檢測，NGS可以幫助解釋此種情況[14]。有研究對NICU中的48例新生兒(非IMD疑似患兒)進行了NGS，共檢測到11例新生兒中有13種可能致病或致病突變，該研究的入選人群并不局限于懷疑患有特定遺傳代謝病者，為NGS用于NICU中患兒疾病的篩查提供了參考[15]。但是，由于測序結果的解釋可能會模棱兩可，測序中還會有次要發現，而且父母可能因為其產生的焦慮情緒及經濟壓力，使這種方法在臨床上的運用受到了阻礙[16]。

2.2高通量測序技術應用于普通新生兒的篩查

基因組測序作為“個性化”或“精確”醫學的一部分，在醫學領域具有更廣泛的實際潛力[17]。1990年，沃爾特·吉爾伯特(Walter Gilbert)就預示了這一點，其推斷到2030年或2040年，所有新生兒出生時都會進行基因測序，有朝一日基因測序將成為NBS的重要手段。

普通新生兒無相關的臨床表型，對其進行基因測序主要是為了當前或未來疾病發生風險的預測。早些年，僅有少許國外文獻報道將NGS用于普通新生兒疾病的篩查[18]。對于發病概率很小的無癥狀人群，基因組測序的陽性或陰性預測價值尚不清楚，但是對于目前缺乏常規生化NBS方法的罕見疾病，可以將NGS用于一階篩查，篩查何種疾病需要仔細考慮各種因素，如發病年齡、嚴重程度、外顯率、確診方法、可治療性及預后[16]。BabySeq計劃[19]也是NSIHT項目之一，目的在于探索NGS在健康和患病新生兒中的應用情況，并評估NGS的醫學、行為和經濟影響。它對127名普通新生兒和32名NICU中患兒進行WES測序，結果提示9.4%(10個普通，5個NICU)的新生兒有兒童期患病風險；另外在85名(3.5%)父母同意接受檢測關于成人發病風險變異的新生兒中，發現有3名(3.5%)會導致遺傳性乳腺癌、卵巢癌或林奇綜合征的致病變異，還發現有7名新生兒與藥物基因組學的相關變異[7]。該研究表明了NGS可以提醒攜帶者的父母注意遺傳風險，輔助臨床醫生為患兒家庭提供生育咨詢，且藥物基因組變異可以指導患兒選擇用藥。BabySeq計劃還分析了493位新生兒父母及144位臨床醫生對NBS和NGS效用和差異的看法，大多數父母(71%)和臨床醫生(51%)都認為NGS對孩子健康有益，但其覺得NGS(35%，70%)比NBS更具有風險(19%，39%)(均P<0.05)。與臨床醫生相比，新生兒父母們認為NGS的益處更多，風險更小；而與其父母相比，臨床醫生更關注與基因測序相關的隱私和歧視問題。大多數父母(93%)和所有臨床醫生(100%)都同意新生兒在出生后均應進行NBS，但只有33%的父母和8%的臨床醫生認為所有新生兒都應進行基因測序[20]。所以當想要將NGS廣泛實施前，除了關注其在臨床上使用的優勢和缺點外，還有必要去了解新生兒父母和臨床醫生對NGS的態度、看法，以及怎么接受和評價NGS的診斷結果。

3展望與挑戰

高通量測序可通過一次性檢測數千種致病變異縮短診斷疾病的時間，甚至可檢測出未知的基因突變，明確未來疾病的發生風險，為早期干預、預防健康問題提供可能。這一系列優勢使其近幾年得到了迅速發展，但與此同時，它也面臨著諸多挑戰。第一，主要是對基因變異的解釋，尤其對特定變異可能出現的臨床表型、嚴重程度和發病時間的預測尤其困難，現仍然缺乏足夠大的特定種族基因數據庫來準確評估某些變異的可能致病性。這些無法解釋的突變，統稱為意義未知的突變(VUS)，會構成風險低估(突變是致病的，與疾病相關，被解釋為良性)和風險高估(良性突變被誤解為致病)的雙重危險。所以這一難題需要通過國際間聯合構建共享數據庫，以可靠的實驗室快速診斷技術，解決龐大的數據分析問題。第二，目前全國范圍內的NBS是國家優生優育強制性的政策。若在新生兒篩查中引入NGS，因為涉及隱私、倫理問題及對意義未知突變帶來的心理壓力，可能會遭到父母的拒絕。針對這種情況，可以設計一組與可防可治疾病相關的高風險基因突變位點進行靶向基因測序，并且這些疾病得到良好預后的關鍵是從新生期或幼兒時期就開始干預。同時，它也不太可能取代目前所有的NBS手段，因為串聯質譜等生化測試在檢測某些疾病方面更具有優勢，所以須將各種檢驗手段依據其優勢應用于臨床，才可以使檢驗手段更加成熟完善。