貝氏柯克斯體IV型分泌系統效應蛋白研究進展

張 珊, 趙明亮, 付夢姣, 張家寧, 周冬生, 熊小路

貝氏柯克斯體是一種專性細胞內寄生的嗜酸性革蘭陰性小桿菌，為Q熱病原。Q熱是一種重要的人獸共患病，人Q熱主要傳染源是貝氏柯克斯體感染的家畜(如牛，羊)，其排出貝氏柯克斯體污染環境[1]，人吸入少量貝氏柯克斯體氣溶膠而發病[2-3]。Q熱分為急性和慢性2種類型。急性Q熱為貝氏柯克斯體進入體內引起急性發病，主要有頭痛、發熱等類似流感臨床表現。慢性Q熱為貝氏柯克斯體持續存在體內建立慢性遷延感染，可引起心內膜炎、肝炎、骨髓炎等并發癥[1]，嚴重可導致死亡。Q熱為一種全球廣泛分布傳染病，Q熱暴發流行已經成為世界性公共衛生問題。

貝氏柯克斯體除具有脂多糖內毒素外，其還具有重要的致病因素——Dot/Icm IV型分泌系統(Dot/Icm IV secretion system，T4BSS)。其分泌至宿主細胞的效應蛋白(效應子)，目前已鑒定了150多個。隨著貝氏柯克斯體體外培養[4]和遺傳操作技術[5]的建立，轉座子插入和同源重組技術被廣泛應用于研究T4BSS基因突變或缺失對貝氏柯克斯體胞內生存的影響。Weber等發現Cbu0041(cirA)、Cbu0388、Cbu0425(cirB)、Cbu0937(cirC)、Cbu2052(cirD)和Cbu2059(cirE)等T4BSS基因的插入失活會導致貝氏柯克斯體無法在小鼠巨噬細胞系中生存[6]。Newton等發現，Cbu1751(cig57)、CoxCC8和Cbu1754等T4BSS基因的插入失活影響貝氏柯克斯體在HeLa細胞中的繁殖[7]。Crabill等構建了貝氏柯克斯體突變體文庫，發現貝氏柯克斯體Cbu0414、Cbu0513、Cbu0978、Cbu1387、Cbu1524和Cbu1752等T4BSS基因插入突變株在宿主細胞內生存能力下降[8]。

本文對近十多年來貝氏柯克斯體T4BSS效應蛋白的研究進行綜述，以便從分子水平認識貝氏柯克斯體的致病機制。見圖1。

圖1 貝氏柯克斯體Dot/Icm IV型分泌系統效應蛋白調控宿主細胞的信號通路Fig.1 Signaling pathways of host cells regulated by Dot/Icm type IV secretory system effector proteins in Coxiella burnetii

1 促進貝氏柯克斯體寄生泡發育成熟

貝氏柯克斯體為專性胞內寄生菌，其首先與宿主細胞的膜表面受體αvβ3整合素等作用，誘導宿主細胞胞吞將其攝入胞內，形成含貝氏柯克斯體的吞噬體。吞噬體循經典的內吞途徑，依次與早期內體、晚期內體、溶酶體融合并不斷酸化，形成貝氏柯克斯體寄生泡(Coxiella-containing vacuole，CCV)[9]。在此過程中，CCV還與宿主細胞自噬體和內體囊泡發生異型融合，最終在宿主細胞內發育成一個占據胞質大部分空間的成熟CCV[10]。成熟的CCV是貝氏柯克斯體在細胞內建立穩定感染的必要場地。

柯克斯體囊泡蛋白(Coxiella vacuolar protein，Cvp)為T4BSS效應蛋白，其定位于CCV內。Larson等研究發現效應蛋白基因cvpB、cvpC、cvpD和cvpE缺失突變株在細胞內的復制能力下降，形成的CCV有明顯缺陷，而cvpD和cvpE基因回補株可以在一定程度上填補該缺陷[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3 kinases，PI3Ks)是一類可產生第二信使的脂類激酶，其中PI3Ks激活生成的磷脂酰肌醇3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI(3)P)是誘導細胞自噬的關鍵因子[12]。磷脂酰肌醇5-激酶(Phosphatidylinositol 5-kinase，PIKfyve)可將PI(3)P磷酸化為PI(3,5)P2；PI(3,5)P2的生成不利于宿主細胞的早期內體或晚期內體的同型融合[13-14]。Martinez等研究發現，貝氏柯克斯體cvpB::Tn突變株感染引起宿主細胞呈多囊泡表型，cvpB回補株感染則可使宿主細胞恢復呈現單一大CCV；抑制PIKfyve的活性則可形成單一大CCV(發育成熟CCV)，且該CCV中含有LAMP1(Lysosome-associated membrane glycoprotein 1)和LC3(Microtubule-associated protein light chain 3)。這些結果表明效應蛋白CvpB通過與CCV和早期內體表面的PI(3)P和磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)相互作用，干擾早期內體招募PIKfyve，并降低PIKfyve的活性，抑制PI(3)P向PI(3,5)P2轉化，穩定CCV上的PI(3)P水平，從而促進其與其它囊泡融合，使CCV發育成熟[15]。

另外研究發現，CvpF能夠特異地與宿主細胞自噬相關的GTPase RAB26相互作用，CCV招募自噬體標志物MAP1LC3B/LC3B(Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta)，調控內體轉運和自噬，為CCV成熟提供條件[16]。共定位實驗顯示相較于野生型或回補株，cvpF::Tn突變株CCV招募的LC3B在數量上明顯減少，說明CvpF可以促使CCV招募自噬體標志物。異位表達貝氏柯克斯體CvpF-HA后，與僅表達HA的細胞相比較，其SQSTM1(Sequestosome 1)水平更高；SQSTM1是一種與自噬有關的泛素結合蛋白，提示CvpF有調節宿主細胞自噬的功能[16]。另外，由于RAB26可以參與溶酶體定位、自噬體成熟和囊泡介導的腎上腺素能受體分泌等過程[17-19]，因此推測CvpF可能作為鳥苷交換因子(GEF)或GDI置換因子(GDF)，錨定RAB26并激活其在早期內體或前自噬體上的作用，促進貝氏柯克斯體CCV的發育成熟。

2 重塑宿主細胞骨架

細胞骨架是由蛋白纖維交織形成的立體網狀結構，包括微管、微絲和中間絲，成束的肌動蛋白絲通過黏著斑與細胞外基質相連形成應力纖維[20]。Rho(Ras homologus oncogenes)蛋白在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器，調控細胞骨架運動和細胞形態等[21]。效應蛋白CirA(Coxiella effector for intracellular replication A)含有3個精氨酸指狀基序，與Rho 蛋白家族RhoA(Rho1同源物)相互作用[22]。Weber等構建了2個RhoA突變體，分別是RhoA Q63L(持續GTP結合的激活態)和RhoA T19N(持續GDP結合的失活態)。與僅轉染CirA或共轉染CirA和RhoA T19N的細胞比較，共轉染CirA和RhoA Q63L的細胞內應力纖維增多，圓形細胞數量減少。提示存在柯克斯體CCV上的CirA，可以使用CCV上RhoA激活GTP酶，引起宿主細胞骨架重塑[23]。

另外研究發現AnkF與宿主細胞骨架III型中間絲蛋白分子——波形蛋白相互作用，但AnkF并不在轉錄或翻譯水平上影響波形蛋白；在CHO細胞中過表達的AnkF與波形蛋白共定位，且波形蛋白由原來的絲狀排列變為點樣分布，推測AnkF通過改變波形蛋白的裝配和細胞內定位從而干擾其功能。免疫熒光分析法觀察到貝氏柯克斯體感染的細胞中AnkF可以招募波形蛋白到CCV，且波形蛋白水平隨CCV的發育成熟而有所上升。貝氏柯克斯體在內源性波形蛋白敲除的細胞中生長繁殖不受影響，推測有其他的細胞骨架蛋白彌補了波形蛋白缺失所帶來的影響。在CHO細胞中過表達AnkF和波形蛋白，通過免疫熒光分析發現其他的細胞骨架蛋白如肌動蛋白和微管蛋白的定位未發生改變，即AnkF可特異地調節波形蛋白的定位[24]。

3 調控宿主細胞物質分泌和運送

網格蛋白介導的內吞可以調控細胞對轉鐵蛋白的攝取以及蛋白質在內體與高爾基體間的運輸[25-26]。此外，網格蛋白介導的轉運對貝氏柯克斯體的胞內生存也十分重要。效應蛋白Cig57含有3個胞內分選基序，其中的酪氨酸基序是與網格蛋白包被囊泡組分——FCHO2相互作用的基礎，可促使柯克斯體CCV招募網格蛋白，逆轉網格蛋白介導的囊泡轉運[7,27]。用定量PCR分析貝氏柯克斯體感染宿主細胞的荷菌量，與正常細胞相比較，FCHO2基因敲除細胞在感染后第2、4、6 d，荷菌量呈下降趨勢；通過免疫熒光分析發現FCHO2基因敲除細胞在感染第4 d后，柯克斯體CCV明顯縮小[27]，提示Cig57需要與FCHO2相互作用介導物質轉運才能誘導CCV成熟。

效應蛋白CvpA包含多個雙亮氨酸和酪氨酸的內吞分選基序，可被網格蛋白銜接蛋白(Adaptor protein，AP)復合物AP1、AP2和AP3識別。免疫共沉淀分析發現，含有CvpA分選基序的多肽和完整CvpA蛋白均能與AP2和網格蛋白重鏈(Clathrin heavy chain，CLTC)結合；cvpA突變或AP2和網格蛋白的任一成分缺失均可顯著抑制貝氏柯克斯體生長繁殖[28]。此外，異位表達的CvpA定位于轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)陽性囊泡，同時該細胞攝取轉鐵蛋白(Transferrin，Tf)減少，提示CvpA可抑制胞內轉鐵蛋白的轉運[28]。另外，AP2基因敲除細胞的轉鐵蛋白攝取也減少[29]，提示CvpA可與AP2相互作用調控宿主細胞物質轉運[28]。

效應蛋白ElpA具有2個跨膜螺旋和1個螺旋結構域的(ER-localizing protein A)，其定位于內質網。研究顯示表達完整ElpA的細胞比表達GFP和表達ElpA1-343/ElpA341-418的細胞分泌更少堿性磷酸酶；進一步研究發現ElpA能夠引起宿主細胞內質網重排，導致內質網結構和分泌運送的嚴重破壞[30]。蛋白CBU0635是目前發現的唯一一個定位在高爾基體旁的效應蛋白，其也可破壞細胞的堿性磷酸酶分泌[31]，另外效應蛋白CBUA0019、CBU1556、CBU1825也可能影響宿主細胞分泌。

4 調控宿主細胞轉錄和翻譯

生物信息學分析顯示貝氏柯克斯體6個效應蛋白(Cbu1314、Cbu0388、Cbu1524、Cbu0393、Cbu0794)帶有核定位信號(Nuclear localization signals，NLS)。其中CBU1314含有2個進入核內的必須信號：第52～75位氨基酸序列(ELVKRIRVLEKVLKEQQKKIKKLE)和第181～186位氨基酸序列(KPPIRP)。Weber等研究發現，完整CBU1314蛋白主要定位在細胞核染色質，而刪除核定位信號的CBU1314ΔNLS缺失蛋白在染色質上的數量明顯減少；經染色質免疫共沉淀及DNA測序(Chromatin immunoprecipitation and DNA sequencing，ChIP-Seq)和MEME(Multiple EM for Motif Elicitation)測序分析發現，CBU1314蛋白可以識別宿主DNA的特定區域，該區域的大多數基因參與宿主細胞的轉錄、信號轉導和免疫應答[32]。比較異源表達CBU1314和CBU1314ΔNLS細胞的轉錄組時，證明CBU1314在核內調控宿主細胞轉錄[32]。

宿主細胞的轉錄、翻譯與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated prote in kinase，MAPK)信號通路密切相關[33]。研究發現效應蛋白CBU0388(CetCb2)、CBU0885(CetCb4)和CBU1676(Cem9)分別通過對信號通路中一個或多個分子的磷酸化修飾，特異地調控酵母MAPK信號通路[34]。基因序列分析發現CBU0885和CBU1676蛋白均含有一個抑制MAPK活化的鹵酸脫鹵酶(Haloacid dehalogenase，HAD)保守結構域[34]。

5 抑制宿主細胞凋亡

宿主細胞是貝氏柯克斯體賴以生存之地，因此延長宿主細胞的壽命是其致病所必須具備的能力。AnkG(Ankyrin repeat family G)、CaeA(Coxiella anti-apoptotic effector A)和CaeB(Coxiella anti-apoptotic effector B)是目前已知的3個由T4BSS分泌的抗宿主細胞凋亡(Apoptosis)效應蛋白。三者均可抑制宿主細胞的內源性凋亡，CaeA還可作用于外源性凋亡通路[35]。

宿主細胞的p32是一種促凋亡蛋白，主要分布在線粒體，少量位于細胞核[36-37]。p32與Hrk(Bcl-2促凋亡家族成員之一)結合可促進細胞色素c的釋放，p32與ARF(ADP-ribosylation factor)C-末端結合定位于線粒體發揮促凋亡作用[38-40]。免疫熒光和免疫印跡實驗也顯示效應蛋白AnkG與p32結合定位于線粒體，序列分析發現AnkG的N-末端含有與宿主蛋白p32結合的關鍵結構域。AnkG不含NLS，但經星形孢菌素誘導細胞凋亡后，細胞內的AnkG定位發生改變，主要位于細胞核。另外發現AnkG突變體AnkGR22/23S不能與p32結合，該突變體主要與微管蛋白共定位[41]。

星形孢菌素誘導細胞凋亡發現，與僅表達GFP的細胞比較，表達GFP-AnkG和GFP-NES-AnkG(GFP-AnkG fused to the nuclear export signal of the HIV-1 Rev protein)細胞的細胞核裂解水平降低[41]，說明AnkG依賴與p32結合轉運至細胞核才能發揮抗凋亡作用，但該抗凋亡作用與p32無關。另一方面，Lührmann等人利用嗜肺軍團菌鞭毛蛋白缺失株來研究AnkG的抗凋亡作用，指出AnkG可以通過干擾p32的促凋亡活性，使細胞色素c釋放減少來發揮抗凋亡作用[42]。Importin α1是輸入蛋白家族中的重要成員之一，協助含有NLS的蛋白分子入核，通過識別和結合靶蛋白的核定位信號，與其他相關蛋白分子結合形成核轉運復合體，將目的蛋白運輸到核內發揮作用[43]。Sch?fer等認為AnkG不含NLS，但其8到14個氨基酸具有與非經典NLS相似作用；他們通過免疫共沉淀實驗又發現importin α1可與AnkG的11個氨基酸序列相結合而將AnkG轉運至細胞核，其與p32無關；但他們最后認為AnkG的入核轉運需要與p32和importin α1共同參與[44-45]。

CaeA定位于細胞核。CaeA含有的雙螺旋結構域、NLS和谷氨酸/賴氨酸(Glutamic acid/lysine，EK)重復基序，這些結構是其抗凋亡的分子基礎[31,46-47]。CaeA的表達可上調survivin(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制劑)表達水平，但與抗凋亡作用無直接關系[46]。星形孢菌素和紫外線誘導凋亡實驗顯示，CaeA僅能減少由紫外線誘導的多聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)裂解；而CaeB可抑制星形孢菌素和紫外線誘導的PARP裂解，說明CaeA抗凋亡能力弱于CaeB[47]。此外，CaeA可抑制Fas配體誘導的外源性凋亡，然而，CaeA抑制內源性和外源性凋亡的具體機制尚未完全闡明[46]。

CaeB定位于線粒體，免疫共沉淀實驗發現CaeB不與p32結合[47]，提示其發揮抗凋亡作用與結合p32的AnkG不同。細胞凋亡過程中Bax(Bcl-2-associated X protein)和Bak(Bcl-2 homologous antagonist/killer)形成寡聚物，線粒體外膜通透性增強，細胞色素c釋放到細胞質，促使細胞色素c與caspase-9結合形成凋亡小體，激活caspase-3和caspase-7[48]。多西環素誘導Bax表達后，GFP-CaeB能抑制細胞內PARP的裂解[47]，說明CaeB作用于Bax活化后的下游反應來發揮抗凋亡作用。經星形孢菌素處理后，僅表達GFP的細胞PARP、caspase-9和caspase-7均裂解，而表達GFP-CaeB的細胞caspase-9和caspase-7均未裂解[47]，說明CaeB抑制caspase-9的活化。綜上所述，CaeB可能作用于Bax和caspase-9間的級聯反應從而發揮抗凋亡作用。

6 抑制宿主細胞炎性反應

細胞炎性反應為天然免疫反應，在抗胞內菌感染中起重要作用。炎性小體為調節天然免疫反應的是一類多蛋白復合物，其功能包括激活caspase-1(人和小鼠)、caspase-4/5(人)、caspase-11(小鼠)，促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的分泌，誘導細胞焦亡/炎性壞死(Pyroptosis/Inflammatory necrosis)等[49-50]。細胞焦亡途徑可分為依賴caspase-1的經典途徑和依賴caspase-4/5/11的非經典途徑，其中非經典途徑主要由革蘭陰性細菌分泌的脂多糖所激活[50]。Cunha等[51]發現T4BSS效應蛋白IcaA(Inhibition of caspase activation A)可以抑制caspase-11介導的非典型性炎性小體激活，從而干擾細胞焦亡的發生。

Ras家族蛋白是一類小分子GTP酶，通過與GTP或GDP結合調節其活性，當與GTP結合時Ras蛋白呈活化狀態，為含NLS的蛋白分子的核轉運提供能量[52]。有研究證實真核細胞中的RCC1可以作為Ran(為Ras家族的核運輸蛋白)的鳥苷交換因子與宿主細胞核染色質相互作用[53]。效應蛋白NopA(Nucleolar protein A)C-末端含有4個染色體聚縮調控(Regulation of chromosome condensation，RCC)重復序列，與Ran-GEF RCC1的7個重復序列同源[54]。含RCC的完整NopA分子主要定位于細胞核，而不含RCC的NopA肽則在宿主細胞質中彌散分布，說明RCC對NopA分子進入胞核至關重要[55]。免疫印跡法發現NopA與Ran-GDP相互作用，使細胞內Ran-GTP水平升高和Ran活性增強，通過干擾p65轉錄因子入核而抑制NF-κB信號通路，從而抑制宿主細胞炎性反應[55]。

7 其他亞細胞定位明確但功能尚未明確的效應蛋白

效應蛋白AnkB(Ankyrin repeat family B)富含錨蛋白重復序列。Rodríguez-Escudero等通過DAPI染色實驗發現AnkB定位于酵母細胞核，且過表達AnkB的酵母細胞對氨基葡萄糖苷敏感，其可能是通過干擾核糖體基因的表達，影響蛋白質合成[56]，但是它如何進入胞核和確切功能有待進一步研究闡明。

MceA/B/C/D/E(Mitochondrial Coxiella effector protein B to E)是5個靶向線粒體的效應蛋白，MceB和MceC沿線粒體小管均勻分布，MceD和MceE在線粒體呈點狀分布[57]。免疫沉淀實驗顯示MceC可結合線粒體組分，如iAAA蛋白酶、YME1L和CLPB(Caseinolytic peptidase)。MceA的N-末端含有2個跨膜結構域，在線粒體外膜上組裝成一個同源寡聚復合物[58]。MceA(CBU0077)可與LAMP1共定位[31]，亦可存在內質網去改變內質網的形狀與結構[56]。Fielden推測CBU0077定位于不同細胞器是因為真核細胞產生的MceA折疊狀態與菌體自身表達的MceA結構不同有關[58]。

Cpe(Coxiella plasmid effector protein)B、CpeC和CpeD為貝氏柯克斯體質粒編碼的T4BSS效應子。真核異位表達的CpeB與LC3B陽性的自噬體囊泡共定位，提示CpeB可能調節了宿主細胞的自噬進程[59]。CpeC含F-box結構域，與泛素連接酶復合物SCF蛋白(Skp1-Cul1-F-box蛋白，SKP1：S-phase kinase-associated protein 1)結合，定位于富含泛素的腔內[59]。F-box蛋白超家族介導的泛素化可以改變蛋白質功能或降解靶蛋白，進而調節宿主細胞的天然免疫、炎癥反應和細胞凋亡等[60]。CpeD與鈣連蛋白共定位，破壞內質網網絡[59]；CpeD含有一個與鞭毛蟲驅動蛋白同源的結構域，其可能引導囊泡沿微管運輸[61]。

8 結 論

隨著貝氏柯克斯體體外培養技術和遺傳操作方法的發展，貝氏柯克斯體T4BSS和效應蛋白的研究已經取得重要進展[4-5, 62-63]。研究證明T4BSS是貝氏柯克斯體重要的毒力因素，其分泌的效應蛋白能夠調控宿主細胞的柯克斯體CCV發育成熟、宿主細胞的物質分泌運送、自噬與凋亡、炎性反應等一系列生理和病理過程，為貝氏柯克斯體生長繁殖提供場所和物質。這些研究成果為研究貝氏柯克斯體的分子致病機制提供新思路，并為更有效防治Q熱提供理論依據。