蒲公英根際微生物分離及生化初步鑒定

郭曉農，張 妍，董江陵，姬冰茹

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室,甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心中國-馬來西亞國家聯合實驗室,甘肅 蘭州 730030)

植物根際是植物與土壤進行能量交換最活躍部位，絕大部分物質、能量與信息交換在這一小部分區域內進行[1].隨著現代農業的發展，化肥、農藥等化學品的過度使用，以及人們中長期連作影響，使得土壤結構被破壞，土地荒漠化、鹽堿化加重，進而導致作物質量下降[2-3]，因此，人們開始關注具有環保、安全等特點的根際微生物[4].根際微生物根據其對植物的作用可以分為有益微生物、中性微生物和有害微生物三類[5]，而人們常用的是有益微生物，比如植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR，簡稱促生菌).植物根際促生菌(PGPR)的生存和對環境的適應能力較強，不同的植物根際有不同的菌群，對植物起著直接或者間接的作用，影響植物的生長發育.PGPR可以分泌多種植物激素來促進植株的生長，比如細胞分裂素、赤霉素、生長素等[6].可以通過分泌嗜鐵素或產生氰化物等防治植物病害,提高植株的抗逆性[7]，還可以促進礦質營養吸收利用和植物生長，抑制有害微生物[8].王艷霞[9]、鄭娜[10]、王琦琦[11]等人通過分離鹽堿化土壤中的菌株篩選出耐鹽脅迫的根際促生菌，發現PGPR是通過誘導植物產生耐受機制，以確保植物能在鹽堿化環境中生長[12].

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，為多年生草本植物，種類繁多[13-14]，屬于藥食兩用的材料[15-16]，常被作為藥物使用.在《唐本草》、《本草綱目》、《中國藥典》等典籍中都有記載[17]，被稱為“天然抗生素”.蒲公英形態優美，耐寒耐旱[18-19]，其化學成分較為復雜，從中分離出的化合物多達50種，有多糖類、芬酸類、黃酮類、香豆素、甾醇類等[20-21]，其廣泛應用于現代藥理學中.目前的研究多集中于蒲公英的生物活性物質，但對于蒲公英根際微生物的研究卻鮮有報道.

蒲公英具有較強的環境適應能力，為了研究蒲公英根際微生物的多樣性，本實驗以西北民族大學榆中校區蒲公英根際土壤為材料，開展蒲公英根際微生物初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

蒲公英，樣品采集于西北民族大學榆中校區(104°9′E，35°56＇N)，采集生長良好的蒲公英作為根際微生物分離材料.

1.1.2 培養基及試劑

牛肉高蛋白胨固體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，pH調至7.4.

吲哚試劑：對二甲氨基苯甲醛1 g，于95 ml 95%乙醇中溶解，之后緩慢加入20 ml濃鹽酸.

1.2 試驗方法

選取肉眼觀察后形態不同的菌落進行四區劃線，對菌種進行分離、純化，最終得到單菌落后做生化鑒定.首先從平板觀察培養菌落形態，并拍照記錄，然后通過生理生化實驗對照《伯杰細菌鑒定手冊》確定菌種類別.其中生化鑒定包括：形態觀察、革蘭氏染色、觸酶實驗、吲哚實驗等.

1.2.1 菌種分離純化

將所采樣取根部至于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，放入恒溫震蕩箱中180 r/min 30℃震蕩12 h，然后取出進行梯度稀釋，吸取菌液涂布均勻后培養[22-23].挑取形態不同的菌落采用四區劃線法于培養皿中劃線稀釋，直到出現單菌落后測定菌株的生理生化指標.

1.2.2 革蘭氏染色法

在載玻片中央滴加一滴0.9%生理鹽水，用滅菌接種環挑取菌落放入鹽水中，均勻涂片，風干后，用結晶紫染液染色1～2min，水洗，用碘液覆蓋1min，水洗，吸干水分后滴加95%乙醇脫色，水洗，吸干水分，番紅復染2min，水洗后晾干鏡檢[24-26].

1.2.3 吲哚實驗

于蛋白胨水培養基中接種菌株，37 ℃下培養72 h，沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑，觀察實驗結果，同時做空白試驗.若乙醚層呈現玫瑰紅色，則說明可產生吲哚，此為吲哚實驗陽性反應，用“+”表示，否則為陰性反應，用“-”表示.

1.2.4 過氧化氫酶實驗

用滅菌接種環挑取實驗菌株于干凈的載玻片上，之后滴加3～4滴5%過氧化氫溶液，觀察結果.若0.5 min內產生氣泡，則為陽性，反之則為陰性.

2 結果

2.1 菌株的分離純化

通過平板劃線法進行分離、純化，得到單菌，進行革蘭氏染色等生化鑒定試驗.通過實驗，觀察菌落涂布可以發現，當選取濃度較高的菌液進行涂布時，培養皿上生長的菌落過于密集，所以涂布時選取的菌液濃度要適當.

2.2 形態觀察

在分離純化得到的微生物菌株中，對其進行形態特征的觀察，并拍照記錄單菌落的形態特征，作為鑒定菌株的依據，圖1為分離純化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培養基平板上的菌落特征.

由圖 1可知，1號菌株的菌落為白色，形態較大，呈圓形，中部隆起；2號菌株的菌落為白色，此菌株在培養相同時間內能夠產生代謝物，形態較小，為圓形；3號菌株的菌落為黃色，形態較小，邊緣較為平整，呈圓形；4號菌株的菌落呈黃色，形態較大，中間隆起，呈圓形.

2.3 革蘭氏染色

革蘭氏陽性菌(G+菌)細胞壁中肽聚糖含量高，細胞壁厚.肽聚糖網狀結構可以保留碘-結晶紫絡合物，因此革蘭氏陽性菌經復染劑染色后仍然是藍色；革蘭氏陰性菌(G-菌)細胞壁中肽聚糖含量低，細胞壁薄.用乙醇或丙酮脫色后，細菌變成無色，染色劑重新染色后，變為復染劑顏色.因此革蘭氏陽性菌染色后為藍紫色，革蘭氏陰性菌染色后為紅色.

A：1號菌株；B：2號菌株；C：3號菌株；D：4號菌株 A：1號菌株；B：2號菌株；C：3號菌株；D：4號菌株

由圖 2可以看出，1號菌株，形態呈桿狀，部分彎曲，經革蘭氏染色后呈現紅色，為革蘭氏陰性菌；2號菌株，形態呈球形，經革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌；3號菌株，形態呈球形，多粘連在一起為鏈狀，經革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌；4號菌株，形態呈直桿狀，經染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌.

2.4 吲哚實驗

由吲哚實驗發現，1號、2號、3號、4號菌株的乙醚層均未呈現玫瑰紅色，說明這四種菌株都不能夠產生吲哚.

2.5 過氧化氫酶實驗

表1 過氧化氫酶實驗結果

由表1可知：1號菌株為厭氧菌，2號、3號、4號菌株均為好氧菌.

2.6 菌株鑒定結果

表2 菌株鑒定結果

通過對分離、純化后的菌株進行形態觀察、生理生化等試驗，查閱《伯杰細菌鑒定手冊》進行對照后發現，1號菌種屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，2號菌種屬于微球菌屬(Micrococcus)，3號菌種屬于鏈球菌屬(Streptococcus)，4號菌種屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，分離菌株均為土壤中常見菌屬，體現了蒲公英根際微生物的多樣性[27].

3 討論

通過革蘭氏染色等生理生化試驗發現，分離得到的4株單菌分別為假單胞菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬，其中假單胞菌屬為變形菌門，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬為厚壁菌門，由此推測，蒲公英根際微生物的優勢菌門可能是厚壁菌門.對比其他植物根際微生物的研究，錢蘭華等[28]對江蘇南通海邊灘涂的土壤樣品中篩選出5株耐鹽菌株，發現其中具有耐鹽促生能力的是巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)；汪婭婷等[29]對云南玉米根際微生物進行研究發現，在所研究的樣地中，變形菌門在細菌群落分布中的相對豐度最高，擬桿菌門、變形菌門和放線菌門是共同具有的優勢菌門.說明，不同土壤當中根際微生物的組成和結構不同，但厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等為共有的優勢菌門.

根際促生菌在土壤中長期生存，形成了許多優良特性，比如PGPR能夠通過促進植物對于養分的吸收或者產生激素類物質來促進植物的生長發育，這樣既可以提高植物次級代謝產物的積累，又可以誘導植物體內的抗病性或抗逆性，使植物對病害或逆境及時發出響應，以增強植物的抗逆性[30-31].基于這幾種優良特性，PGPR 被用作植物生物制劑或生物防治制劑，而PGPR 生物制劑可以部分或完全代替化學肥料、殺蟲劑等微生物制劑[32-33].因此，利用土壤有益微生物開發菌肥、菌劑等產品具有廣闊的應用前景[34].

4 結論

本次實驗以蒲公英根際土壤為實驗材料，共分離得到4種菌株，分別為假單胞菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬.其中，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬對植物生長有促進作用，屬于根際有益微生物，即根際促生菌[35].假單胞菌和芽孢桿菌是土壤中常見的根際促生菌株.