與番茄頸腐根腐病緊密連鎖的SCAR標記開發

程 琳張曉艷魏美甜倫堯堯趙 靜王曉武李傳友

（1 農業農村部設施蔬菜種質創新重點實驗室，山東省設施蔬菜分子育種省級重點實驗室，山東省蔬菜工程技術研究中心，山東壽光蔬菜種業集團有限公司，山東省壽光蔬菜產業集團有限公司，山東壽光 262700；2 壽光市農業技術中心，山東壽光 262700；3 山東壽光歐亞特菜有限公司，山東壽光 262700；4 山東省生物化學與分子生物學高校重點實驗室，濰坊學院生物與農業工程學院，山東濰坊 261061；5 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；6 中國科學院遺傳與發育生物學研究所，北京 100101）

由尖孢鐮孢菌番茄頸腐根腐病專化型（Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici，FORL）引起的番茄頸腐根腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）（Yamamoto et al.，1974；Jarvis &Shoemaker，1978）是一種重要的土傳病害（Benaouali et al.，2014），主要表現為植株莖基部交接處、環繞莖基部有明顯的深褐色病斑，被侵染植株苗期易從病斑處折倒而萎蔫致死，5 葉期以后至開花結果期發病則表現為莖基部縊縮、呈深褐色，植株仍然直立而萎蔫致死（耿麗華 等，2012）。

該病害于1974 年首次在日本發現，隨后在美洲、歐洲和非洲等多個國家發生，造成嚴重損失（Sonoda，1976；Jarvis，1988；Rekah et al.，1999；Jacobs &Heerden，2012）。最近幾年，我國東北、華北地區發病比較嚴重，尤以山東省壽光地區病情最為突出。壽光日光溫室番茄發病率達80%以上，致死率達30%以上，造成嚴重減產，已成為山東省繼線蟲、黃化曲葉病毒病等毀滅性病害暴發之后的另一普遍性番茄病害（程琳 等，2016）。

番茄頸腐根腐病的病原菌侵染周期相對較長，目前還沒有安全有效的防范治療措施（Liu et al.，2010），因此選育抗番茄頸腐根腐病的番茄新品種就成為科學有效的方法。傳統育種一般通過人工接種，篩選F.oxysporumf.sp.radicis-lycopersici的抗性材料（Staniaszek et al.，2014）。這個過程耗費時間長、成本高、人工量大。在番茄中，對FORL 的抗性是由1 個顯性單基因Frl控制的，而這個基因來源于Solanum peruvianum（Yamakawa &Nagata，1975；Berry &Oakes，1987），并且在已知的3 份抗源材料中抗病基因都是一種（Kamilova et al.，2006）。Frl基因定位在番茄9 號染色體的長臂端，與Tm-2基因緊密連鎖（Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999）。Fazio 等（1999）發現了1 個與Frl基因緊密連鎖的RAPD 標記，Tanyolac 和Akkale（2010）、Truong 等（2011）也開發得到了一些CAPS 標記，但準確性都無法令人滿意。Staniaszek 等（2014）找到了1 個與Frl基因緊密連鎖的分子標記C2-25，此標記經過酶切，可有效篩選抗病材料。但是CAPS 標記需要酶切，成本高，試驗程序繁瑣，檢測效率低。

本試驗利用C2-25 引物，以25 份背景不同、抗性已知的番茄材料為模板，分別進行PCR，挑取單克隆并測序，得到了抗感病序列。根據抗感病序列的差異位點，分別設計抗病和感病SCAR 標記，利用親本以及F1篩選得到抗病、感病混合引物對，并用F2群體成功進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017 年1—6 月在山東省蔬菜工程技術研究中心基地日光溫室內進行。使用程琳等（2016）鑒定出的25 份番茄材料進行抗病、感病序列測定。SCAR 標記篩選及驗證使用抗病親本P51、感病親本P284 及其F1、F2材料。用于測序的25 份材料以及親本P51、P284，F1材料各種植15 株，F2材料種植700 株。所有材料于2017 年1 月15 日播種，2 月15 日定植，常規田間管理。

病原菌為2014 年9 月在山東省壽光市稻田鎮西劉營村農戶日光溫室內典型番茄頸腐根腐病發病植株上采集，按常規方法保存。

1.2 DNA 提取與PCR 擴增

采集已知表型的25 份材料以及鑒定出表型的親本F1、F2植株的葉片，采用改良的CTAB 法（Fulton et al.，1995）提取各單株的DNA，利用Staniaszek 等（2014）設計的C2-25 引物序列及新設計的SCAR 引物序列進行PCR。

C2-25 引物膠回收PCR 體系：上下游引物各5 μL，DNA（提取后的DNA 稀釋10 倍）20 μL，10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 20 μL，dNTPs（2 mmol·L-1）20 μL，MgSO4（25 mmol·L-1）12 μL，KOD-Plus-Neo（1 U·μL-1）4 μL，ddH2O 114 μL。PCR 反應程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 個循環；68 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，電壓100 V，電泳30 min，紫外燈下切膠和拍照。

C2-25 引物菌落PCR 體系：上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司）10 μL，菌液1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應程序同上。

SCAR 標記篩選的PCR 體系：抗病/感病上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。SCAR 標記群體驗證的PCR 體系：抗病上下游引物各0.5 μL，感病上下游引物各0.5μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。SCAR 標記PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸（延伸時間根據延伸速度1～2 kb·min-1計算），35 個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.3 DNA 片段連接轉化

1.3.1 PCR 產物回收 使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，切膠回收PCR 產物。

1.3.2 產物加A 尾 使用北京艾德萊生物科技有限公司的TaqDNA Polymerase 試劑盒加A 尾。反應體系：回收產物30 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，dATP（10 mmol·L-1）1 μL，ddH2O 13 μL。輕彈混勻，瞬時離心，在PCR儀上72 ℃延伸30 min。

1.3.3 產物連接轉化 使用北京艾德萊生物科技有限公司的零背景pTOPO-TA 克隆試劑盒。連接體系為：pTOPO-T 載 體1 μL（30 ng·μL-1），10×Enhancer 1 μL，PCR 純化產物8 μL（約50 ng）。加入試劑后吹打混勻，低速瞬時離心，收集離心管底部的所有液體，室溫連接5 min。

取50～100 μL 感受態細胞，置于冰上解凍，加入5 μL 連接液，吹打混勻，室溫放置5 min。加入300～500 μL 無抗體的LB 培養液，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養10 min。在含有氨芐青霉素（80 μg·mL-1）的LB培養基上培養過夜。挑取單菌落，搖菌，通過PCR 選擇條帶大小正確的菌液，每個培養皿選擇3 個菌液送至英濰捷基（上海）貿易有限公司測序。

1.4 InDel 標記開發、篩選及驗證

利用在線比對網站CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw/），比對抗病序列和感病序列，根據二者的差異位點，分別設計了抗病引物和感病引物。無論是正向引物還是反向引物，務必確保引物3′端末位堿基為突變堿基。

將退火溫度相近、條帶大小合適的引物，分別組合成抗病引物對和感病引物對。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選多態性引物對。將退火溫度相近、條帶大小合適的抗病引物對和感病引物對混合，以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選多態性混合引物組合。

在F2群體中，利用篩選得到的混合引物對進行群體驗證，將帶型與表型鑒定結果對比，驗證標記準確率。

1.5 番茄材料抗病性人工接種鑒定

參照程琳等（2016）的方法，將番茄頸腐根腐病病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，置于搖床中以25 ℃、120 r·min-1振蕩培養3 d，過濾除去菌體，配制濃度為1×107CFU 的孢子懸浮液。番茄材料在滅菌基質中長至1 片真葉時，用清水將根系清洗干凈，放在孢子懸浮液中浸根接種10 min，然后移栽至滅菌基質中，對照用清水浸根10 min，置于18 ℃光照培養箱中培養。接種處理14 d 后，觀察、記錄番茄材料的發病情況。

2 結果與分析

2.1 測序結果分析

經在線序列比對軟件CLUSTALW 比對后，排除隨機突變，19 份純合抗病材料存在1 條完全相同的抗病序列，4 份純合感病材料存在1 條完全相同的感病序列，2 份雜合抗病材料均存在前述的抗病序列和感病序列。從這25 份材料中得到了2 條序列，根據表型區分出抗病序列和感病序列，共找到了18 個差異位點（圖1）。

2.2 SCAR 標記篩選

利用差異位點，設計抗病上游引物8 條，下游引物6 條；感病上游引物7 條，下游引物7 條。選擇退火溫度相近且目的條帶大小在300～1 000 bp的抗病引物和感病引物，分別兩兩組合。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選得到了5 對在抗病材料中有條帶、在感病材料中無條帶的抗病標記R-3F/2R、R-4F/6R、R-6F/2R、R-6F/3R、R-6F/4R，6 對在抗病材料中無條帶、在感病材料中有條帶的感病標記S-3F/2R、S-3F/4R、S-4F/2R、S-4F/6R、S-4F/7R、S-6F/4R（表1）。

在篩選得到的5 對抗病引物和6 對感病引物中，選擇退火溫度相近、條帶差異較大的抗病引物和感病引物，組成20 組混合引物（表2）。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選得到可擴增出370 bp 抗病特異片段和520 bp 感病特異片段的連鎖SCAR 標記R-6F/2R、S-3F/4R（圖2）。

表1 C2-25 及篩選得到的SCAR 引物序列

表2 混合引物組合

2.3 混合標記在F2群體中單株驗證

以混合引物組合在500 株F2群體中篩選，122株材料擴增出370 bp 的條帶，為純合抗病；257 株材料同時擴增出了370 bp 和520 bp 的條帶，為雜合抗病；121 株材料擴增出了520 bp 的條帶，為純合感病（表3）。

采用人工接種鑒定病原菌的方法對親本、F1、F2材料進行抗病性鑒定。結果表明，F2群體中373株材料表現抗病，127 株材料表現感病。抗病材料外觀無顯著變化，感病材料莖基部縊縮，出現褐色病斑，幼苗從病斑處倒折（圖3）。在500 株F2材料中，473 株材料人工接種鑒定結果與分子標記檢測結果一致，準確率達到94.6%。

表3 部分F2個體的分子鑒定結果及人工接種抗病性鑒定結果

3 討論與結論

現有的頸腐根腐病分子標記多為RAPD、CAPS 標記，但有的準確性比較低，有的操作比較繁瑣，需要尋找結果更加準確，操作更加簡便，可用于高通量篩選的分子標記。本試驗利用準確性較高的CAPS 標記C2-25，以25 份不同背景、已知抗性的番茄材料為模板，得到了抗病序列和感病序列，根據序列差異分別設計了抗病引物和感病引物。利用抗病親本、感病親本、雜合F1，先篩選得到了多態性抗病引物和感病引物，之后再將抗病引物和感病引物混合，篩選得到了多態性的抗病、感病混合引物組合，可擴增出370 bp 抗病特異片段和520 bp 感病特異片段。

在500 株F2材料中，473 株材料人工接種鑒定結果與分子標記檢測結果一致，準確率達到了94.6%。仍有27 株材料檢測結果不一致，這種差異可能與這個分子標記和抗病基因Frl間尚存在一定的連鎖距離有關，因此后續研究可開發與抗病基因Frl連鎖關系更近乃至基因內部標記，從而提高分子標記鑒定的準確度。同時，為了提高通量，配合LGC 技術，也應該開發SNP 分子標記。