莖用萵苣肉質莖內綠色組織光合特性探析

朱俊杰王天順牙 禹廖 潔閆飛燕

（1 廣西大學林學院，廣西南寧 530004；2 廣西壯族自治區農業科學院農產品質量安全與檢測技術研究所，廣西南寧 530007）

莖用萵苣（Lactuca sativaL.var.asparaginaBailey）是菊科萵苣屬植物，營一年或二年生，別稱萵筍、萵苣筍、香筍等（袁慶軍和楊昌煦，2002）。食用時汁液濃郁、脆嫩可口，可生食、涼拌、炒食、干制或腌漬，含有豐富的蛋白質、脂類物質、碳水化合物、維生素（如尼克酸）和礦質元素（如鐵、鋅）等各種營養成分（高天啟，2018），還具有良好的保健功效，對改善糖代謝、鎮痛、刺激消化、分解亞硝胺等均有一定的作用（戴國輝 等，2008）。莖用萵苣在我國各省（市）大面積種植，是響當當的大眾蔬菜，蔬菜市場的“壓艙石”。

在北方地區，秋冬季低溫是限制莖用萵苣生產的主要因素，大棚生產雖然可部分解決低溫問題，但成本較高。南方地區盡管一年可以三季甚至四季生產莖用萵苣，但夏季高溫也嚴重影響其產量和品質?？傮w看，莖用萵苣的單產和品質還有較大的提升空間。光合作用是植物生產的物質和能量源泉（South et al.，2019），莖用萵苣干物質絕大部分來自光合作用，產量提升和品質改良離不開對光合作用的系統和深入研究。目前莖用萵苣光合特性的研究已經有一些零星報道，但這些研究主要集中于施肥對莖用萵苣葉片光合氣體交換特性的影響上（曾希柏，1997；李會合 等，2004；王菲 等，2016；張迎春 等，2020），而莖用萵苣葉片葉綠素熒光特性研究方面還鮮有報道。

莖用萵苣的食用部分包含幼嫩葉片，但主要是肉質的莖內組織。與其他可食莖蔬菜如洋蔥、藕、慈姑、荸薺、馬鈴薯、大蒜、百合相比，莖用萵苣莖內含有更多的葉綠素，組織更為脆嫩，含水量更為豐富。莖瘤芥、抱子芥等蔬菜的莖內組織表層也分布有綠色組織，但其深入莖內的深度和持久度則無法和莖用萵苣相比，在老化之前，莖用萵苣莖內深層組織葉綠素含量比表層組織更多。在植物學上，非葉片綠色組織，如莖稈、葉柄等的光合能力和機制近年來受到關注，這些組織的光合特性和葉片有明顯差別（Xu et al.，1997；張永平 等，2011；張金堯 等，2014）。本試驗的第一個目的是以葉片為對照，對比監測分析莖內深層組織的光合特性，揭示其光合能力和可能機制。根據植物生理知識，綠色組織中葉綠素的形成和維持需要持續不斷的光環境（史典義 等，2009），而成熟的莖用萵苣莖內深層組織一直是無光環境，這似乎與生理理論相悖。細胞分裂素具有保綠功能（王三根，2000），是否與莖用萵苣莖內綠色組織存在關聯？對莖用萵苣品質有怎樣的影響？這是本試驗要回答的第二個問題。這兩個問題的探索，將為植物光合作用理論研究及莖用萵苣產量和品質改良提供新視角。

1 材料與方法

1.1 材料

將30 g 市售莖用萵苣品種四季大尖葉（桂林市桂華種子有限責任公司）種子平均分成3 份，于2019 年8月2 日播種于廣西大學試驗基地，播種地塊平均分成3 份，每份3 m2。出苗后按尿素225 kg·hm-2、硝酸鉀300 kg·hm-2追肥1 次，常規管理，生長至11 月30 日收獲。

1.2 方法

1.2.1 葉片和莖內組織葉綠素熒光特性的測定 在上述樣地每個地塊中選取無明顯蟲害、長勢中等的莖用萵苣3 株，共9 株，收獲當日每樣株選取莖稈中上部健康成熟的6～8 片葉，在凌晨天亮前3：00—5：00 用調制葉綠素熒光成像系統IMAGIN G-PAM MINI-版（德國walz 公司）中的測量光測定基底熒光Fo，再打開飽和閃光監測最大熒光Fm 值，根據兩參數自動獲得Fv/Fm。然后再換一個部位測定吸光系數Abs，用于后續相對電子傳遞速率的計算。數據保存后開啟250 μmol·m-2·s-1活化藍光進行葉綠素熒光慢速動力學曲線誘導4.5 min，記錄穩態熒光值（Ft）、非光化學能量耗散效率（qN）、光化學能量耗散效率（qP）、相對電子傳遞速率（ETR）、光化學能量耗散Y（Ⅱ）、非光化學耗散Y（NPQ）和組成型能量耗散Y（NO）等熒光參數值。最后開啟相對電子傳遞速率（ETR）和熱耗散速率（NPQ）的光響應曲線測定，設1 500、1 000、800、400、300、200、130、70、40、20、0 μmol·m-2·s-1共11 個光照強度（PPFD）梯度，每梯度持續時間為3 min。

葉片熒光參數值測定完成后，將莖用萵苣樣株砍收，帶回實驗室用清水沖洗3 遍，用毛邊紙吸干多余水分，再將中上部葉片標記后收集起來供后續其他指標測定。最后將9 株樣株莖稈從底部向上縱向剖開，在剖面上根據綠色的深淺和莖稈實際所處部位，分為上、中、下3 段，每段分別按上述方法測定縱向剖面組織的各項葉綠素熒光參數值，另外再取少量樣株，在莖段相應部位橫切，按上述方法測定橫切面各項葉綠素熒光參數值，以驗證縱切面所獲結果的可靠性（圖1）。

1.2.2 葉片和莖內組織含水量的測定 從上述9 株樣株上每株分別隨機抽取3 片標記葉片，9 片一組，去頭去尾后取中段，稱取并記錄鮮質量，隨后放入3 個不銹鋼盒，轉入烘箱，在120 ℃殺青1 h，然后轉入牛皮紙信封烘至恒重，再根據鮮質量和烘干后干質量差計算含水量（%）。莖段內組織含水量測定和葉片類似，不同的是從莖內組織切取小段莖，稱取鮮質量后需切成薄片，然后再殺青、烘干。

1.2.3 葉片和莖內組織葉綠素含量的測定 從上述9 株樣株上每株取3 片葉，9 片一組剪碎混勻后稱取1.0 g。莖內綠色組織取樣時3 株一組，按圖1 標注，分部位切出小段莖塊，每組中每部位各稱取1.0 g，然后在黑暗冰浴條件下，用80%的冷丙酮研磨成勻漿，再經雙重濾紙過濾至50 mL 容量瓶定容，最后在分光光度計（日本，島津UV1001）上讀取645 nm 和663 nm 下的光吸收值，根據下述公式計算葉綠素含量（Lichtenthaler &Wellbum，1983）。

其中，Vs是定容后的體積，W是組織質量。

1.2.4 葉片和莖內組織玉米素含量的測定 分別用上述方法，從剩余的葉片和莖內組織各取樣1 g，先用5 mL 80%冷甲醇勻漿，勻漿液轉入冷藏管，加入15 mL 冷甲醇密封后于4 ℃冰箱中過夜。第2 天取出密封液，轉入離心管，4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min，沉淀用少量80%冷甲醇浸提后再離心1 次，合并上清液減壓蒸發至2 mL 左右。濃縮液經0.22 μm 的微孔濾膜過濾，使用高效液相色譜儀（美國，Waters 公司）檢測。色譜條件為：Surfire 150 mm × 4.6 mm C18反相色譜柱；流動相A 為100%色譜級甲醇，流動相B 為純化過濾的0.077%冰乙酸水溶液；梯度洗脫，0～7 min 30%～50% A，7～14 min 50%～55% A，14～16 min 55% A，16～28 min 50% A，流速1 mL·min-1，進樣量15 μL，檢測波長254 nm。玉米素標樣從Sigma 公司購買。

2 結果與分析

2.1 葉片和莖內組織葉綠素熒光值狀況分析

從凌晨最大光化學效率Fv/Fm 值看，莖用萵苣葉片光合機構運轉良好，沒有明顯的逆境脅迫（圖2）。尤其是上段和中段莖內一直處于黑暗條件下的綠色組織Fv/Fm 值也高達0.75 以上，雖然數值和葉片有顯著差異，然而這個結果已經和很多光下健康的高等植物葉片的表現接近。下段莖內綠色組織Fv/Fm 值則比葉片小了將近1 倍（圖2），可能是組織更老化，葉綠素含量降低的結果，但對于一直處于黑暗條件下的組織來說，這個Fv/Fm 值也很高。從Fo 值看，中上段莖內組織還略高于葉片，下段莖內組織則下降了近一半。這些結果表明，莖內深處綠色組織是有光合潛能的。

圖3 顯示的是莖用萵苣不同組織從黑暗條件經250 μmol·m-2·s-1光化光誘導后能量分配的情況。葉片中主要光能用于光化學反應Y（Ⅱ）消耗；熱耗散Y（NPQ）消耗的能量占比相對較低，且和其他莖段內組織差別不大。而莖的內部組織中，上段莖內組織吸收的光能有31%通過Y（Ⅱ）途徑消耗；中段莖內組織Y（Ⅱ）耗能比例明顯高于上段莖內組織；下段莖內組織Y（Ⅱ）耗能比例遠低于其他組織，而組成型Y（NO）能量耗散比例則明顯高于其他組織。

表1 顯示了莖用萵苣葉片和莖內組織從暗處經光誘導后主要葉綠素熒光參數值的變化狀況，總體看，葉片中穩態熒光值（Ft）、非光化學能量耗散效率（qN）、光化學能量耗散效率（qP）和相對電子傳遞速率（ETR）等參數值都顯著高于莖內組織，莖內組織中以中段組織表現較好，除qP 和上段莖內組織差異不顯著外，其他參數值均顯著高于上段和下段莖內組織，下段莖內組織的所有參數值都顯著低于上段和中段組織。

從ETR 的光響應曲線看，各光強梯度下葉片ETR 值明顯強于各莖內組織（圖4-A），莖內組織間以中段稍高于上段，上段又強于下段。這個結果一方面反映了葉片是主要光合器官的事實，另一方面也預示莖內綠色組織有一定光合潛能。NPQ 也是植物組織消耗多余光能的重要途徑，莖用萵苣各組織NPQ 值均隨著光強的增加而呈直線上升，葉片比莖內組織上升得更快更明顯，莖內組織中也是以中段表現最佳，下段最弱（圖4-B）。

表1 莖用萵苣不同組織從暗處經光誘導后主要葉綠素熒光動力學曲線參數值

2.2 莖用萵苣葉片和莖內組織水分、葉綠素、玉米素含量及相關性分析

如圖5-A 所示，葉片含水量雖然接近90%，但顯著低于莖內組織。莖內組織含水量以中段最多，高達95.73%，上段次之，下段最少。多數蔬菜作物幼嫩器官含水量往往比成熟器官高，莖用萵苣也是如此。

從外觀上看，葉片綠色要淺于莖內組織，但由于莖內組織含水量較高，從以鮮質量為基礎的葉綠素含量實測值來看，葉片還是顯著高于莖內組織（圖5-A）。莖內組織中又以中段最高，顯著高于上段和下段，這和視覺效果是相符的。從葉綠素a 和葉綠素b 的比值看，葉片（3.14 ± 0.02）顯著高于莖內組織（上段1.97 ± 0.01，中段2.12 ± 0.03，下段1.89 ± 0.02），說明莖內組織中葉綠素b的占比更高，這也是它看起來比葉片更綠的原因。

由圖5-B 可知，葉片內玉米素含量顯著低于莖內組織，莖內組織中，中段顯著高于上段和下段，下段略低于上段，這個分布狀況和含水量的分布是相似的。

僅僅從莖內組織看，葉綠素含量和含水量是顯著的正相關關系，如果把葉片也考慮進來，則這種相關性就很弱了（圖5-A）。葉綠素的卟啉環本身是一個親水基團，可能在莖用萵苣莖內起到保水作用。與此類似，莖組織內玉米素含量和葉綠素含量也呈顯著的正相關關系（圖5-B）。同樣，如果把葉片也納入，則這種相關性幾乎就沒有了。

3 討論

3.1 莖用萵苣莖內綠色組織的強勁光合潛力及原因分析

從莖用萵苣莖和葉片葉綠素熒光特性的對比看，黑暗中生長的莖用萵苣莖內組織具有很強的光合潛能（圖2～4），至少有很強的光能轉換和利用潛力，尤其是莖中段的綠色組織。葉綠素熒光參數Fv/Fm 值是反映植物潛在光化學效率的可靠指標（Demmig-Adams et al.，1996），同時也是反映植物耐受光抑制能力的重要參數（Che et al.，2020）。大量研究結果表明，高等健康綠色植物葉片經過一個夜晚的恢復后，其凌晨Fv/Fm 值通常在0.75 以上（Smillie et al.，1988）。本試驗中莖用萵苣上段和中段莖內組織Fv/Fm 值在這一范圍內，預示其較高的光化學效率。將莖用萵苣莖內組織從黑暗轉到活化光下經過一段時間光誘導，葉綠素熒光發射量達到穩態后，監測光能分配利用的結果表明，上段和中段莖內組織通過光化學途徑耗散的光能所占比例較大，進一步驗證了其高效的光化學能力。葉綠體內囊體膜上的電子傳遞是植物將光能轉換為化學能的核心環節，電子傳遞能力將直接決定光能的利用水平。從莖用萵苣莖內組織電子傳遞速率的表現看，盡管和葉片有差距，但其絕對值并不比其他植物葉片低，再次印證了莖內組織的光合潛能。

植物非葉片綠色組織的光合作用近些年來引起了研究者們極大的興趣，他們對植物果皮（黃仁 等，2019）、葉柄（胡文詩 等，2019）、枝條和莖表皮（劉濤 等，2019）等綠色組織的光合能力進行了一些探索性的研究，發現了一些特殊的光合機制。例如，Hibberd 和Quick（2002）在煙草中發現，與葉片的C3途徑光合作用不同，莖和葉柄是C4途徑的光合作用，其碳源來自微管組織而非氣孔。和上述這些非葉片綠色組織不同，莖用萵苣的綠色組織深埋在莖內部，太陽光不可能到達，而中段和上段莖內組織光化學潛力（Fv/Fm）比下段組織還更高一些（圖2）。光合作用整個過程大體分為光反應和碳反應兩個階段，兩階段均需要光的參與，而莖用萵苣莖內組織根本就沒有獲得光的機會。那么，莖用萵苣在長期的進化中為什么保留這種特性呢？在莖用萵苣的栽培管理過程中，筆者偶爾會發現少量莖稈破裂的植株，以及少量被昆蟲或老鼠等小動物啃食后被風吹斷的植株，對這些莖用萵苣植株來說，這時莖內綠色組織額外補充的光合產物有助于完成生活史。生產實踐中，這些植株通常能繼續頑強地生長，并從傷口附近長出新葉，這也許是一種進化生存策略。

3.2 莖內深層組織葉綠素長期維持的一種可能機制及作用

葉綠體是光合作用的結構基礎，葉綠體中葉綠素的形成和維持需要一定的光照條件（史典義 等，2009），而莖用萵苣莖內深層組織長期處于黑暗條件下，莖內組織的葉綠體是依靠什么機制長期在黑暗條件下維持一定的葉綠素含量呢？細胞分裂素是植物體內一種重要的天然激素，主要在根系合成，然后運送到細胞分裂和生長比較旺盛的組織中，細胞分裂素的主要功能除了促進細胞分裂和生長外，還有保幼和保綠的效應（王三根，2000）。對于莖用萵苣來說，其莖內肉質組織是生長和代謝最旺盛的部位，細胞分裂素有可能是一個重要因素，葉綠素含量的維持也可能與此有關。玉米素是高等植物內常見的一種內源細胞分裂素物質，其功能在多種植物中都得到驗證（董學會 等，2001；李志康 等，2018；陳婷婷 等，2019）。從莖用萵苣組織的測定結果看，莖內組織確實含有比葉片更高的玉米素，并且生長旺盛的中段莖含量最高，而且玉米素含量和葉綠素含量在莖內是一種正相關關系（圖5），因此極有可能是細胞分裂素（這里是玉米素）在促進莖用萵苣組織細胞分裂和生長的同時維持細胞的幼嫩和綠色狀態。然而莖用萵苣莖內這些綠色組織除了應對突發災害（如莖稈破裂和折斷）時可能提供額外光合產物外，是否還有其他功能？葉綠素的合成和維持是需要消耗一定碳水化合物的，目前認為葉綠素的主要生理功能是吸收光能并進行光物理和光化學反應。從分子結構看，葉綠素分子骨架含有一個大的卟啉環，這個卟啉環是親水基團，可以在周圍聚集大量水分子。本試驗結果證實，莖用萵苣莖內組織葉綠素含量和含水量呈顯著的正相關關系（圖5）。在生產實踐中也不難發現，越是生長旺盛充分的莖用萵苣莖內組織，其綠色也越深，含水量也越高，而隨著莖內組織的老化，綠色組織逐漸失水變色并空心化；干旱條件下，莖用萵苣莖內組織綠色明顯減弱，水分含量也減少，這也從側面印證了上述機制。

4 結論

和葉片相比，莖用萵苣莖內深層綠色組織葉綠素熒光特性暗示其具有較強的光合潛能。本試驗預示著這種潛在光合能力所需的光合色素可通過細胞分裂素的作用在黑暗條件下長期維持，同時莖內綠色組織對維持莖內高含水量起作用，是莖用萵苣產量和品質形成的重要生理基礎。莖用萵苣品種選育中可重點考慮細胞分裂素含量高的材料。