吉林省玉米種植區土壤真菌群落多樣性特征研究

王媛媛，王繼巖，焉 莉*，韋大明，高 強

（1.吉林省商品糧基地土壤資源可持續利用重點實驗室，吉林農業大學資源與環境學院，吉林 長春 130118；2.總量控制與排放交易研究中心，國家生態環境部環境規劃院，北京 100085）

吉林省位于我國東北地區中部，土地面積約18.74萬km2，農業自然生態環境良好。吉林省是我國重要的黑土地保護區。玉米是吉林省第一大糧食作物，根據中華人民共和國國家統計局數據統計［1］，2017年吉林省玉米播種面積占全國玉米播種面積的8.72%，而產量占全國玉米產量的12.55%。除了現代的耕作技術外，肥沃的土壤是促其高產的主要原因，但近年來黑土區土壤退化嚴重。土壤微生物群落反映的土壤質量和生態系統變化是判定土壤的性質和生態功能的重要指標［2］。因此可以通過分析和解釋土壤的異質性，從微生物的群落結構組成來探究土壤微生物的變化特征［3］。

土壤微生物對外界的感知能力極為敏感［4-5］，真菌是土壤微生物中數量最多的類群之一，是陸地生態系統的重要組成［6-7］，在提高土壤有機質、改良土壤［8］、增加植物多樣性、提高生態系統生產力［9］等方面有顯著作用，是評價生態系統健康的重要指標［10-11］。同時，土壤的理化性質和土壤酶

活性對微生物群落結構組成也有一定的影響［12］。相關研究發現，土壤有機質含量與土壤微生物多樣性呈正相關［13］。史銘儡等［14］研究發現，pH與真菌數量呈正相關，有機質、有效磷、速效鉀、堿解氮與真菌數量呈負相關，且土壤的pH是影響土壤真菌數量的主導因素。近年來，高通量測序技術因其準確率高，靈敏度好，單次分析樣品量大等優勢［15］，已成為研究土壤微生物的主要方法。

本研究以吉林省玉米種植區的72個樣本土壤為研究對象，測定其土壤理化性質、酶活性及真菌微生物的群落結構，探索吉林省玉米主產區的土壤微生物構成特點及差異，以期闡明土壤群落與土壤養分之間的相互關系，為黑土區退化土壤恢復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

吉林省位于我國東北中部，東經121°38′～131°19′，北緯40°52′～46°18′。地勢東南高、西北低，分為山地和平原兩大地貌區。土壤樣品采集于吉林省玉米主要種植區的9個市，分別位于延邊、白山、吉林、通化、四平、遼源、長春、白城、松原，各個采樣點的詳細信息如表1所示，地理位置信息見圖1。本研究于2017年6月上旬對吉林省各玉米主產區土壤樣品進行采集，土壤類型包括黑土區的白漿土、黑土、暗棕壤、黑鈣土和風沙土，采樣深度0～20 cm，采用五點采樣法，共采集了75份不同的土壤樣品，每種土壤樣品重復采集3次，試驗結果取其3次重復的平均數，以確保試驗的精確度。其中有3個土壤樣品因基礎信息丟失，故將這3個樣品進行剔除，將剩余合格的72個樣品進行多樣性分析，以確保試驗的準確性。所有樣品采集后立即過2 mm篩，然后分成3份，1份保存于-80℃冰箱中用于高通量測序，1份存放在4℃冰箱用以測定土壤的酶活性，1份土壤風干保存用以測定土壤的理化性質。

表1 吉林省土壤樣品采集地理位置詳細信息

1.2 理化性質、酶活性的測定和高通量測序

1.2.1 理化性質及測試方法

風干的土壤樣品用以進行理化性質的分析：pH值用電位法測定［16］，水土比為2.5∶1；土壤有機質含量用重鉻酸鉀容量法［16］（外加熱法）測定；堿解氮含量用堿解擴散法［16］測定；有效磷用鉬銻抗比色法（0.5 mol/L 碳酸氫鈉浸提）［16］測定；速效鉀用火焰光度法（醋酸銨浸提）［16］測定。

1.2.2 酶活性及測定方法

測定方法：保存于4℃冰箱中的土壤樣品進行酶活性測試：脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定［17］，以24 h后1 g土壤中含NH3-N的毫克數表示。蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定［18］，以24 h后1 g干土生成葡萄糖毫克數表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法（酸性磷酸酶用醋酸鹽緩沖液，中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液，堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液）測定［18］，以24 h后1 g土壤中釋放出酚的毫克數表示。每個樣品均做無基質對照和無土對照，且所有樣品均做3次重復，以盡可能消除誤差，來保證試驗數據的準確度。

1.2.3 Miseq高通量測序分析

保存于-80℃冰箱中的土壤樣品采用Fast DNA SPIN提 取 試 劑 盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，United States），每個樣本稱取0.5 g土壤以提取DNA，通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。質量合格的樣品送至上海派森諾生物公司采用ITS5F/ITS2R對土壤真菌進行Miseq測序，首先對ITS區進行擴增，擴增前引物序列為GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，后引物序列GCTGCGTTCTTCATCGATGC。使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進行建庫。對合格的文庫，在 MiSeq 機器上利用 MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）進行 2×250 bp 的雙端測序。

1.3 數據分析

使用QIIME中的OTU表計算操作分類單元中Chao1指數、Shannon指數、ACE指數以及Simpson指數。使用R軟件生成維恩圖，分析樣品中的共有和獨有OTU數量關系。利用SPSS 18.0進行不同類型土壤真菌豐度數據的單因素分析（ANOVA），用Duncan分析不同土壤類型間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同土壤類型的理化性質

不同土壤類型的土壤化學性質表現出顯著差異（表2），且pH值的差異性尤其顯著。其中，黑鈣土的pH偏高，呈堿性；風沙土和黑土的pH值在6～8之間，呈中性；暗棕壤和白漿土pH偏低，呈酸性。暗棕壤、黑土及白漿土的有機質含量較高，黑鈣土次之，風沙土有機質最低。堿解氮、速效鉀和有效磷含量也有相同趨勢，通過表2分析可知，風沙土的土壤肥力顯著低于其他4類土壤類型。

表2 不同土壤類型的理化性質

2.2 不同土壤類型的酶活性特征

土壤酶來源于土壤微生物，與土壤理化性質、土壤類型等密切相關，本文選用脲酶、蔗糖酶以及磷酸酶3種酶作為代表性酶。土壤脲酶是土壤中最活躍的水解酶之一，其活性和微生物量、有機質含量、有效磷含量呈正相關，可表征反映土壤中的氮素含量，其活性的提升有利于使土壤中穩定的有機氮向有效氮轉化［19-20］；一般中性土壤脲酶活性大于堿性土壤［21］。通過表3分析可知，在本次調查的土壤樣品中，5種不同土壤類型中脲酶活性的差異顯著，黑鈣土和風沙土的脲酶含量明顯低于其他3種土壤類型，可能是黑鈣土和風沙土的pH相對較高造成的。

蔗糖酶是重要的水解酶，可直接參與土壤有機質的代謝，反映土壤生物學活性強度［22］，參與碳水化合物的代謝和轉化，將高分子糖分分解為葡萄糖和果糖，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越強，是表征土壤碳循環和生物化學活性的重要酶［18，23］。本研究發現，黑鈣土和風沙土的蔗糖酶活性顯著優于其他3種土壤。

土壤磷酸酶是催化有機磷化合物的酶，可保證土壤、植物和微生物無機磷的供應，其活性影響土壤有機磷的分解轉化及其生物有效性［24］。根據分析發現，pH偏堿性的黑鈣土和風沙土土壤的堿性磷酸酶活性較高，白漿土、黑土、暗棕壤等pH偏酸性土壤的酸性磷酸酶偏高。

表3 不同土壤類型酶活性 ［mg/（g·d）］

2.3 不同類型土壤真菌多樣性指數

Alpha多樣性指數是反映菌群豐富度和均勻度的綜合指標，Chao1 和ACE數值越大表示該土壤類型中真菌微生物的豐富度越高；Shannon和Simpon為該土壤類型中真菌群落多樣性指數，Shannon數值越大，說明其群落多樣性越高，Simpon又稱優勢度指數，其值越高表明其群落多樣性越低，相對來說，Simpon指數對物種均勻度更為敏感，而Shannon指數對物種豐富度更為敏感［25］。根據Alpha多樣性指數（表4）可知，從Chao1指數和ACE指數可以看出，黑鈣土和風沙土的平均值顯著高于白漿土和暗棕壤，具有較高的真菌菌群豐度；變異系數和標準差都是反映數據離散程度的絕對值，從各土壤類型的變異系數可看出，黑土、黑鈣土和風沙土3種類型土壤的Chao1指數變異系數分別為18.91%、17.84%和17.31%，顯著低于白漿土和暗棕壤的變異系數，說明黑土、黑鈣土和風沙土3種土壤類型的樣本間差異相對較小，真菌微生物的均勻度較好。從Shannon和Simpon指數分析結果表明，5種不同土壤類型的真菌多樣性差異不顯著，Simpson指數的平均數在0.94～0.96之間，Shannon指數的平均數在5.97～6.26之間，其變異系數均較低，且相同土壤類型的不同樣本間差異不顯著。

表4 不同土壤類型Alpha多樣性指數

2.4 不同類型土壤真菌群落結構組成

在本研究的所有土壤樣品中，通過高通量測序及分析得到可分類OTU共4273個，不同類型土壤間OTU種類數目各不相同：白漿土2511個、黑土2393個、暗棕壤2166個、黑鈣土2731個、風沙土2176個。其中5種類型土壤共包含OTU 775個，占各土壤類型的28%～36%。5種土壤類型特有的OTU數目及其所占比例分別為白漿土331個、13.18%，黑土109個、4.55%，暗棕壤156個、7.20%，黑鈣 土401個、14.68%，風 沙 土90個、4.14%（圖2）。這表明同樣種植玉米的土壤中不同類型土壤間真菌群落組成相似，但仍存在部分差異。

土壤真菌在門、綱、屬分類水平上的相對豐度如圖3、圖4、圖5所示。吉林省玉米種植區5種土壤類型72個土壤樣品中共鑒定出9個真菌門，其中，子囊菌門（Ascomycota）為相對豐度最高的優勢菌門（65.21%～80.15%），其次是擔子菌門（Basidiomycota，13.78%～28.06%）和接合菌門（Zygomycota，1.32%～5.13%），壺菌門（Chytridiomycota，0.28%～1.78%）和隱真菌門（Rozellomycota，0.01%～0.05%）占比最少，兩者之和僅為0.99%～2.54%。風沙土、黑鈣土和暗棕壤的子囊菌門相對豐度顯著高于白漿土和黑土，與之相反，白漿土和黑土中擔子菌門的相對豐度顯著高于風沙土、黑鈣土和暗棕壤。而暗棕壤的接合菌門豐度則顯著高于其他4種土壤類型。

在綱水平上，吉林省玉米種植區主要以糞殼菌綱（Sordariomycetes，25.61%～38.20%）相對豐度最高，其次是銀耳綱（Tremellomycetes，3.78% ～ 13.24%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes，7.12% ～ 12.81%）、傘菌綱（Agaricomycetes，3.06% ～ 15.54%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，4.43% ～ 12.75%）和錘舌菌綱（Leotiomycetes，1.83%～ 9.51%）。其中銀耳綱分別在黑土、黑鈣土和風沙土中占據優勢；傘菌綱在白漿土、黑鈣土和暗棕壤中優勢較大；而座囊菌綱在黑鈣土和風沙土中優勢較大。

屬水平上，吉林省玉米種植區不同土壤類型中土壤相對豐度大于1%的菌屬分別是酵母菌屬（Guehomyces，0.26%～2.54%）、青霉菌屬（Penicillium，0.16%～1.30%）和腐殖霉屬（Humicola，0.21%～1.10%）。其中黑土、黑鈣土以及風沙土的酵母菌屬（Guehomyces，0.26%～2.54%）和青霉菌屬（Penicillium，0.16%～1.30%）的相對豐度明顯高于白漿土和暗棕壤；而腐殖霉屬在黑土和風沙土中占據明顯優勢。

2.5 土壤真菌群落與環境因子的冗余分析

為了反映土壤環境對真菌微生物群落組成的影響，將不同土壤類型的土壤理化性質（pH值、有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀）及土壤酶（脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶、中性磷酸酶和酸性磷酸酶）活性與屬分類水平下真菌群落組成，采用冗余分析（RDA）的方法，從而更加直觀、清晰地體現出土壤理化特性對土壤真菌群落遺傳多樣性及優勢類群的影響。圖6中的射線越長，說明該因子影響程度越高，兩條射線夾角為銳角，說明兩因子之間呈正相關；若夾角為鈍角，則說明兩者呈負相關。從不同土壤類型的真菌群落和土壤理化性質及酶活性的RDA分析結果（圖6）可知，土壤環境因子中pH射線最長，有機質次之，因此pH和有機質對真菌微生物群落結構影響程度最高；同時可以看出pH值和蔗糖酶活性、堿性磷酸酶活性呈正相關，且相關性較好；而有機質與中性磷酸酶的相關性較好。從5種土壤類型的分布看，黑鈣土和風沙土分布在PDA1坐標軸的正方向，而白漿土和暗棕壤則分布在PDA1坐標軸的負方向，黑土分布在坐標軸附近；而在PDA2坐標軸上，黑土和暗棕壤則主要分布在正方向，而大部分白漿土分布在負方向，黑鈣土和風沙土則在坐標軸附近。白漿土和暗棕壤樣本分布距離較遠，說明該兩種土壤的微生物群落結構有各自獨特的特點，而黑鈣土和風沙土分布較近，說明這兩種土壤類型的微生物群落結構相似。pH值對黑鈣土和風沙土影響較大，而有機質對黑土及暗棕壤影響較大。綜上所述，土壤pH值和有機質對土壤真菌微生物群落多樣性的影響顯著，是5種土壤類型真菌微生物群落的主要影響因子。

采用R軟件，通過物種豐度矩陣和樣本分組數據構建PLS-DA判別模型，對群落結構數據進行判別。圖7可知，吉林省玉米種植區5種土壤的微生物特征存在一部分共性，也存在顯著差異。暗棕壤和白漿土之間存在明顯的分離，表明了這兩種土壤微生物群落結構存在顯著差異。

3 討論

本次研究發現，吉林省玉米種植區不同土壤類型的理化性質、生物酶活性及真菌群落結構組成存在一定的相似性，但也存在差異。

吉林省是我國玉米的主要產區之一，玉米產量相對較高的是中部平原區［26］，平均產量為9.45 t/hm2，其土壤類型主要是黑土、黑鈣土和白漿土，其有機質相對較高；其次是東部山地丘陵區，平均產量為8.44 t/hm2，主要土壤類型是暗棕壤和白漿土，土壤偏酸；西部風沙草原區的玉米產量相對最低，平均值為8.11 t/hm2，其主要土壤類型是風沙土和黑鈣土，風沙土的有機質相對較低，導致其土壤肥力較差，玉米產量較低。本研究的土壤理化性質分析結果表明，吉林省玉米種植區黑鈣土的pH呈明顯堿性，白漿土、暗棕壤的pH呈酸性，黑土和風沙土呈中性，此結果與王寅等［27］研究結果一致。土壤養分是衡量土壤綜合生產力的重要指標，而土壤有效養分與土壤堿解氮、有效磷和速效鉀之間存在一定的關系［28-30］，本文研究結果顯示，有機質和堿解氮含量最高的土壤類型是暗棕壤，最低的是風沙土，有效磷和速效鉀含量最低的是黑鈣土，這一結果與呂巖等［31］、焉莉等［32］、李春林等［33］、陳敏旺等［34］研究結果相一致。而隨之土壤堿性越強，土壤有效磷含量明顯降低，主要原因是土壤pH對土壤磷的利用及其有效性有一定影響［35］，隨著pH的提高，土壤對磷的吸附降低［36］。

土壤酶是催化土壤有機質分解的活性蛋白質，對植被、水分、營養元素含量等因素十分敏感［37］，脲酶可以將尿素分解成氨、二氧化碳和水，對氮素轉化起重要作用［38-39］；蔗糖酶也叫轉化酶，與土壤有機質含量呈正相關，與土壤pH呈一定的負相關［40］；土壤磷酸酶活性可作為指示土壤肥力的指標，無論是酸性磷酸酶還是堿性磷酸酶都與有機磷和有效磷含量顯著正相關［41-42］。本次酶活性分析結果與李林海等［43］的研究結果相一致，脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性之間呈顯著正相關，且均與pH呈正相關關系。

土壤微生物是土壤地力關鍵驅動因子之一，參與90%左右的土壤反應過程［44］。各地區不同類型土壤中，分布著不同種類結構的微生物，氣候條件不同、成土母質不同的土壤中，真菌多樣性及結構也存在明顯差異。尤其是土壤呈堿性的黑鈣土和弱堿性的風沙土與土壤呈酸性的暗棕壤及白漿土的微生物豐度差異顯著，冗余分析表明pH對其影響顯著，可能原因是pH會影響微生物群落的生長、代謝、底物轉化及菌群構成［45］。前人的很多研究均表明土壤細菌、放線菌、微生物總數與pH值呈顯著負相關，說明高堿性土壤不適合土壤微生物的生長［46-48］。而本研究發現5種不同土壤類型的真菌微生物多樣性差異不顯著，可能由于在局部生態條件相似的不同地區，土壤中的真菌群落極有可能相似［49］。土壤的健康情況可以通過土壤微生物群落狀態和功能變化來表明［50］。本次研究結果表明，吉林省玉米種植區5種類型土壤的子囊菌門和擔子菌門相對豐度較高，是該地區土壤真菌群落中有機質的主要分解者，并參與土壤的氮循環，對植物生長具有重要作用［51］。與此同時，通過Chao1指數和ACE指數可看出，黑鈣土和風沙土的真菌豐度顯著高于白漿土和暗棕壤，且黑土、黑鈣土和風沙土3種土壤類型的變異系數相對較低，說明樣本間差異相對較小，真菌微生物的均勻度較好。黑土區主要土類包括黑土、黑鈣土、白漿土和暗棕壤［52］。黑土和黑鈣土是吉林省主要的土壤類型，是東北溫帶濕潤、半濕潤氣候區草原化草甸植被下形成的具有深厚腐殖質層的一類土壤［53］。因透氣性強、保水性好，自然肥力較高而成為世界最適應農耕的土地。近年研究發現，持續的無機肥大量施用導致微生物群落結構變化，從而引起黑土區退化及生態環境惡化［54］。周晶［55］的研究表明，長期施肥導致黑土區中真菌群落變化顯著，影響了具有某些碳循環和氮循環功能的真菌，刺激有潛在致病力類群真菌的生長繁殖，導致土壤退化。

4 結論

吉林省玉米種植區不同類型土壤的微生物群落結構既有一定的相似性，同時也存在一定的差異性。黑鈣土和風沙土的真菌豐度要顯著高于白漿土和暗棕壤，5種土壤類型的真菌多樣性差異不顯著。土壤pH值和有機質是影響土壤真菌微生物群落多樣性的主要驅動因子。