混施微生物菌劑和有機肥對‘新紅星’蘋果解袋后果實品質的影響

劉洋洋，束懷瑞，陳 偉*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點試驗室，山東 泰安 271000；2.山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018）

蘋果是世界性果品，由于其生態適應性強、果品營養價值高、耐貯性好及供應周期長，世界上相當多的國家都將其列為主要消費果品而大力推薦［1］。蘋果果實含有較多易被人體吸收的游離多酚，在抗氧化、預防心腦血管疾病及抗腫瘤等方面均具有較好的作用［2］。然而我國果園土壤多數瘠薄，有機質含量低（國外果園土壤有機質含量在3%以上，我國多在0.5%～2%之間），果樹根系生活環境因素的穩定性差，嚴重制約了地上部樹體正常生長發育，是果實品質差的主要原因之一。有計劃地增施有機肥是增加土壤有機質含量的重要手段［3］。彭先云［4］研究了有機肥在農產品應用中的作用，表明了有機肥的施加不僅可以改善土壤的狀況，促進微生物的轉化，而且能有效提高農作物的品質。近年來，隨著可持續農業的發展，微生物肥料作為一種新型肥料，對保護環境、促進“綠色和生態農業”的發展有很大幫助，通過所含微生物的生命活動來活化土壤中的養分，促進植物養分吸收及植株生長，提升農產品品質［5］，在改良土壤、抑制病菌、促進作物生長方面具有顯著作用［6］。

近年來，采前套袋技術在果業生產中已廣泛應用。很多研究表明，果實套袋在改善果實外觀品質［7］，減少病蟲害發生的同時，對果實內在品質也產生一定影響［8-11］。Sharma等［12］發現蘋果套袋后果實硬度降低；Amarante等［13］研究表明‘考密斯梨’在貯藏過程中套袋果實更容易軟化；Liu等［14］研究結果也顯示，套袋能影響蘋果果實中糖、酸及其它內含物的含量?！录t星’（Malus domesticaBorkh cv.Starkrimson）原產于美國，1952年由Bisbee發現，1956年正式命名［15］，其果實果面濃紅，色澤艷麗，果形高樁，五棱突出，外形美觀，香甜可口，綜合品質極佳，推出后各國競相引種試栽，中國從1964年引入，并逐步推廣［16］?！录t星’喜光照強、日照時間長、溫差大、氣候相對干燥的環境［17-18］，果實成熟早，樹體強壯、直立，果枝粗壯，易形成短果枝，在山東地區種植適宜采前套袋。

以往套袋栽培的研究多集中于套袋對果皮結構［19］、色澤變化［20］和芳香物質的影響［21］以及套袋時期、方法［22］等方面，而解袋后隨著天數的增長含微生物菌劑的有機肥對蘋果果實品質的影響研究報道較少。故本試驗以山東地區‘新紅星’蘋果果樹為試材，研究含微生物菌劑的有機肥對蘋果解袋后0～15 d內果實內在品質、呼吸速率、乙烯釋放速率、果實細胞顯微結構、硬脆性及關鍵酶和基因表達的影響，從而為科學有效地提高蘋果品質及果實耐儲性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2018年在山東省招遠市金嶺鎮蘋果基地進行，試驗材料為5年生‘新紅星’蘋果樹，試驗于2018年3月進行，選取樹勢一致、生長旺盛的果樹40棵，共設4個處理：T1，5000 g有機肥；T2，5000 g有機肥+10 g微生物菌劑，T3，10 g微生物菌劑；CK，對照。每個處理10棵果樹，施肥用量見表1。除了施肥種類不同，其余種植管理水平均相同。2018年3月5日將肥料均勻撒在樹盤下，2018年9月15日測定供試土壤基本理化指標，結果見表2。2018年9月16日果實解袋，分別在解袋后第0、3、6、9、12、15 d取蘋果樣品，每次取樣時選取樹冠外圍同一高度同一部位的果實，選取大小均一、果面整潔、無病蟲害、無機械損傷的果實，每個處理每次采摘30個蘋果，套網袋后裝入紙箱立即帶回實驗室進行測定。

表1 不同處理施肥用量

表2 土壤基本理化指標

1.2 測定方法

1.2.1 蘋果表皮細胞形態觀察

觀察蘋果表皮細胞形態時用鑷子輕輕將蘋果赤道周圍的表皮撕下并制成玻片，在AXIO熒光顯微鏡下觀察并拍照［23］。

1.2.2 蘋果內在品質測定

可溶性固形物含量用WYT手持糖量計測定；可溶性糖含量采用蒽酮法測定［24］；可滴定酸用酸堿中和滴定法測定［25］。

1.2.3 果實呼吸速率及乙烯釋放速率

用SY-1022果蔬呼吸儀測定呼吸強度；參考Gwanpua等［26］的測定方法，略有改動，采用GC-9A氣相色譜儀測定乙烯含量，利用N2000色譜軟件進行數據處理［27］。

1.2.4 揮發性物質測定

頂空固相萃?。簩⑻O果樣品洗凈，5點均勻取樣，稱取切碎的新鮮果實40.0 g，加入100 mL的錐形瓶中，加入內標物3-壬酮（0.4 mg/mL）10 μL，加蓋封口后于加熱板上平衡10 min。將萃取頭于進樣口250℃老化20 min，取出插入平衡好的樣品瓶中進行吸附，吸附45 min后將萃取頭插入氣相色譜質譜進樣口解析3 min。

氣相色譜質譜分析條件：參照王傳增等［28］方法，利用Shimadzu GC/MS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀。色譜條件：色譜柱Rtx-1MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）柱；升溫程序：35℃保持2 min，以6℃/min的頻率升溫至120℃，保持1 min；以10℃/min的頻率升溫至180℃，再以20℃/min的頻率升溫至230℃，保持5 min。質譜條件：載氣為He氣，流量1.03 mL/min，電離方式EI，電子能量70eV。離子源溫度200℃，掃描質量范圍：45～450 amu。進樣：不分流進樣。

1.2.5 果實硬脆度

用TA.XT Express型質構儀測定蘋果硬脆度，每個處理選擇5個蘋果，每個蘋果選取赤道位置的4個點，結果取20個點的平均值。每次測定要調節參數一致，并且保持蘋果跟探頭垂直接觸［29］。

1.2.6 細胞壁酶活性及其相關基因表達量

根據Wei等［30］描述的方法稍作修改測定細胞壁酶活性；通過QRT-PCR測定參與細胞壁代謝基因的表達［30］，用快速通用植物RNA提取試劑盒3.0（北京）從果實中提取總RNA?；蛱禺愋砸锶绫?，每個基因第0 d的表達水平設定為1.0。除特殊說明，以上所有試驗均設3次生物學重復。

表3 用于QRT-PCR擴增細胞壁酶相關基因表達的引物

1.3 數據處理

所有統計數據通過SPSS 20.0軟件進行顯著性差異分析和相關性分析，并采用Origin 9.4軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蘋果果皮細胞形態的變化

由圖1可以看出，果實成熟時（第15 d）CK組果實細胞排列不緊密，細胞較小不飽滿，著色差；T1組果實細胞大小較均勻，排列較緊密，著色較好；T2組果實細胞較大，細胞間空隙較小，細胞排列緊密，著色較好；T3組果實細胞偏小，細胞間隙較大，著色較好。成熟飽滿、排列緊密的細胞使T2組蘋果能夠更好保持水分，從而更好保持硬脆度，延長貨架期。

2.2 不同肥料處理對蘋果內在品質的影響

由表4看出，果實解袋后可溶性糖和可溶性固形物含量變化趨勢基本一致，呈先上升后趨于平穩的趨勢。T2組果實可溶性糖和可溶性固形物含量在解袋后第6～15 d均顯著高于其他組，果實成熟時（第15 d）兩者含量相對于CK組分別提高了12.86%和8.78%。

果實可滴定酸含量逐漸降低，T2組果實可滴定酸含量在3～15 d均低于其他組，果實成熟時（第15 d）其含量相對于CK組降低了11.86%。

果實糖酸比一直處于上升趨勢，其中在第9～12 d上升速率最為明顯，第12～15 d趨于平穩，果實成熟時（第15 d），T2組果實糖酸比比CK組高出17.08%，果實風味達到最佳。說明添加微生物菌劑的有機肥有利于果實可溶性糖和可溶性固形物的積累，可以降低可滴定酸含量，從而提高果實糖酸比，有利于果實風味的形成。

表4 解袋后果實內在品質的變化

2.3 不同肥料處理對果實呼吸速率和乙烯釋放速率的影響

由圖2A可知，果實呼吸速率在解袋后均逐漸上升，T1、T2、T3組果實在成熟過程中呼吸速率一直高于CK組。其中T1、T2組相對于CK組差異顯著，T1組在0～6 d呼吸速率顯著上升，在6～15 d上升幅度減緩，在第3、9、15 d較CK組分別高出27.4%、40.9%、18.6%。T2組在0～12 d呼吸速率顯著提高，12～15 d呼吸增幅減緩，在第3、9、15 d較CK組分別高出13.8%、35.6%、15.9%。

由圖2B可知，蘋果在解袋后果實乙烯釋放速率均呈上升趨勢，0～12 d乙烯釋放速率上升較快，12～15 d趨于穩定。T3組果實乙烯釋放速率超過其他組，CK組果實乙烯釋放速率一直處于最低。T1、T2兩組在9～15 d差異不明顯，其中T2組在第0、6、12 d較CK組分別高出81.2%、120.4%、23.8%。說明添加微生物菌劑的有機肥可提高果實呼吸速率和乙烯釋放速率，但是作用不明顯。

2.4 不同肥料處理對果實揮發性物質的影響

表5 不同肥料處理對果實揮發性成分的影響

續表

由表5可知，在‘新紅星’蘋果樣品中共檢測到37種香氣物質，酯類是蘋果香氣的重要貢獻者，其中主要的酯類物質是2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-辛基丁酸辛酯。醇類以1-己醇為主，醛類以2-己烯醛為主，烴類中以十四烷為主。果實成熟時（第15 d），T1、T2、T3組果實香氣總含量相對于CK組分別高出8.55%、21.3%、8.2%，其中T2組果實總香氣含量明顯高于其他組，T2組酯類含量相對于CK組高出9.41%，其中丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸戊酯相對于CK組分別高出23.85%、21.5%、30.68%、76.43%；醇類物質T1、T2組顯著高于CK組；T2組醛類物質顯著低于CK組；烴類及法尼烯均高于CK組。說明有機肥與微生物菌劑均可以提升果實中的香氣，其中添加微生物菌劑的有機肥（T2）對果實總香氣物質的提升效果最顯著。

2.5 不同肥料處理對果實脆度的影響

‘新紅星’蘋果解袋后果實脆度均呈上升趨勢，脆度在0～9 d變化不明顯，在9～15 d變化顯著（圖3）。T2組對蘋果脆度的改善效果最好，果實成熟時（第15 d），T2組較CK、T1、T3組分別提高34.5%、20.6%、6.6%。說明添加了微生物菌劑的有機肥（T2）對蘋果脆度改善效果最佳，提高了果實的口感。

2.6 不同肥料處理對果實硬度的影響

由圖4可知，蘋果在解袋后果實硬度呈下降趨勢，解袋后第0～6 d果實硬度變化不明顯，第6～12 d下降速度較快，第15 d時T2組較CK組高出12.8%，果實硬度仍然保持較高水平，由此可知，添加了微生物菌劑的有機肥（T2）對果實硬度的保持具有積極作用，有利于延長果實貨架期。

2.7 不同肥料處理對細胞壁酶活性及相關基因表達的影響

果實硬度主要與果膠甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）兩種細胞壁酶有關，其酶活性與硬度呈負相關。由圖5A、B可知，各組PME、PG的活性在蘋果解袋后均呈上升趨勢，最后趨于穩定。PME活性在解袋后第3～12 d活性增加較快，第12～15 d趨于穩定。其中CK組果實PME活性較高，而T1、T2組PME活性較低。T1組果實在解袋后第3、9、15 d相對于CK組分別減少了7.8%、11.8%、16.8%，T2組在解袋后3、9、15 d相對于CK組分別減少了15.6%、30.2%、35.7%。PG活性在解袋后第0～9 d逐漸增加，第9～15 d趨于穩定。其中CK組PG活性較高，T1、T2組PG活性較低。T1組果實在第3、9、15 d相對于CK組分別減少了27.3%、12.7%、14.1%，T2組在解袋后第3、9、15 d相對于CK組分別減少了21.2%、24.5%、15.3%。

由圖5C、D可以看出，MdPME相對表達量在解袋后先上升后下降，T2組果實在解袋后第3、6、12 d相對于CK組減少了38%、25.7%、19.4%；T3組果實在解袋后第3、6、12 d相對于CK組分別降低了30.4%、20.2%、11.2%。其中0～15 d CK組果實MdPG相對表達量最高，T2組最低，T2組果實在解袋后第6、12、15 d相對于CK組分別減少了15.3%、21.9%、25.4%。說明添加微生物菌劑的有機肥（T2）可以降低果實MdPME和MdPG表達量，從而降低果實PME、PG活性，使得果實保持較高的硬度。

3 討論

科學的肥水管理是蘋果健壯生長和早果豐產的前提條件。每年9月份施基肥，主要以有機肥為主。適量施入有機肥，不僅為果樹生長提供多種營養，而且還能起到改善土壤理化性狀、促進果樹生長的效果［31］?！录t星’蘋果對土壤肥力的要求較高，其產量和品質不高，一直是生產中的主要限制因素，除立地條件以外，肥料的施用對紅富士產量和質量影響較大。因此在施肥種類上選擇以有機肥為主，以少施微生物菌劑為輔，改善土壤結構，提高土壤有機質含量和增加土壤通透性，更利于微生物活動，以發揮有機肥營養成分齊全、肥效緩慢持久及改良土壤等優點。增施含有微生物菌劑的有機肥，可以提供給果樹所需要的各種營養元素，使土壤肥力不斷提高，對果樹的根系生長和分布起到一定的促進作用，增加果樹的吸收根量，增強樹體的營養積累，促壯樹勢，這是果樹豐產穩產的前提和關鍵。

在當前蘋果園密植的前提下，為加強地下管理，國內外果樹工作者對蘋果果皮的解剖結構進行了一些研究，鄧繼光等［32］報道了蘋果品種果實組織結構的差異；果皮是果實抵御外界不良環境的天然屏障，果皮細胞的緊密性不僅與果表面光潔度具有最直接的關系，而且與果實貯藏性能密切相關［33］；宮美英［34］研究發現蘋果果皮結構與耐貯性密切相關。本研究表明，添加了微生物菌劑的有機肥（T2）處理果實著色好，果皮結構緊密，且細胞小、胞壁厚，排列緊密，并有厚角蠟層或木栓層保護，對果實有更好的保護作用，大大提高了解袋后蘋果的商品價值及耐儲性。

果實所積累糖的種類、含量及比率對果實風味、色澤和其它營養成分有重要影響，是決定果實品質和商品價值的主要因素［35-36］。在果實成長成熟過程中，酸含量在幼果中較高［37］，隨著果實發育，一部分酸作為呼吸底物而被消耗，一部分酸轉變為糖，果實中糖酸比得到迅速提高，使果實風味更加濃郁。以往的研究表明，富士系蘋果的酯類物質，尤其是乙酸乙酯等大量酯類物質組分的變化，與果實的風味質量密切相關［38］。本研究表明，在‘新紅星’蘋果解袋后隨著時間的延長各處理可溶性固形物、可溶性糖含量均呈上升趨勢，可滴定酸處于下降趨勢，在第12～15 d糖酸比值達到最大，其中添加了微生物菌劑的有機肥（T2）處理對提升果實糖酸比效果最明顯，可能是微生物菌劑中微生物的活動促進了有機肥中養分的分解，使土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀等已被植株吸收的養分含量增加，從而對果實糖酸比的提升起到關鍵性作用。

有研究表明蘋果果實是一種呼吸躍變型果實，其成熟的特征是乙烯釋放速率和呼吸速率呈指數增長［39］，乙烯在蘋果果實成熟過程中起著關鍵的調節作用，例如揮發性物質合成［40］和花青素積累［41］。據報道［42-43］，構成蘋果香氣的化合物達250種以上，分別為碳水化合物、酯類、醇類、烴類、醛類及環氧化合物，其中對蘋果芳香起主要作用的是前3類物質。研究認為［44-45］有20～40種揮發性成分直接與蘋果香氣特征產生相關，如乙酸丁酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基丁酸己酯以及乙基、丙基的丁酸酯類。本研究結果表明，果實解袋后，隨著果實的成熟，果實呼吸速率及乙烯釋放率都處于上升趨勢，通過對果實香氣的檢測發現酯類總和T2＞T1＞T3＞CK，添加了微生物菌劑的有機肥（T2）處理酯類總量最高，有機肥（T1）其次，可能是果實成熟過程中添加了微生物菌劑的有機肥為果實提供了更多微量元素，對果實成熟過程中酯類化合物的積累起到了關鍵作用。

蘋果在成熟期間，硬度逐漸降低，而脆度逐漸升高，期間發生許多生理和生化變化，是影響果實保質期和商業價值的決定性因素［46］。果實硬脆度是多種細胞結構變化的結果，主要是細胞壁結構的改變。細胞壁結構和組成的變化及細胞壁修飾酶的作用是蘋果成熟期間硬度下降的主要原因［46-48］。細胞壁酶在細胞壁分解的過程中起主要作用，減少細胞間緊密程度，在果實發育的不同階段發揮不同作用［49-50］。PME、PG是作用于細胞壁果膠部分的兩種主要酶，Phan等［51］研究表明成熟期間PME活性降低，果實能保持較好的硬度。本研究表明，不同施肥處理對PME活性及MdPME表達量的影響明顯不同。相對于CK組，T1、T2組顯著降低了PME活性及其基因表達量，其中T2處理效果更顯著。還有研究表明硅酸鈉通過抑制PG的活性來延緩蘋果果實的軟化［52］。PG是另一種細胞壁修飾酶。它將果膠酸與多聚半乳糖醛酸的主鏈一起水解，導致果膠降解，細胞壁溶解，最終果實軟化［53］。本研究表明PG及其基因表達量在解袋后第0～12 d處于上升趨勢，第12～15 d趨于平穩，其中T2組效果較明顯。說明添加微生物菌劑的有機肥（T2）可以降低果實MdPME和MdPG表達量，從而降低果實PME、PG活性，使得果實保持較高的硬度，有利于提高果實的保質期及其商業價值。

4 結論

本研究表明，添加了微生物菌劑的有機肥處理可以顯著提高解袋后蘋果果實內在品質，使果皮細胞排列整齊緊密，減少果實呼吸速率及乙烯釋放速率、提高果實硬脆度、降低細胞壁修飾酶的活性及相關基因的表達水平，從而為科學有效地提高蘋果品質及果實耐儲性提供理論依據。