復合微生物制劑改善土壤生物學特性和防治煙草黑脛病的研究

夏振遠，谷醫林，張宏越，魏海雷*

（1.云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 650021；2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

煙草是我國重要的經濟作物，但是長期以來由于連作和大量化肥的施用，導致土傳病害發生嚴重，煙區土壤質量退化，煙葉品質逐年下降［1］。煙草黑脛病是由煙草致病疫霉（Phytophthora nicotiana）引起的一類土傳真菌病害［2］。該病常致煙草矮化、萎焉、葉片發黃、根和莖基部壞死，是煙草生產中為害最重的病害之一。由于煙草的特殊性，化學農藥防治受到很大限制，也不能滿足綠色生態發展的需求。通過研制兼具土壤營養調控和防病促生的微生物制劑，改善煙田土壤化學和生物性狀，調控土壤養分的供給和利用率，控制病害發生發展是實現煙草農業綠色防控、提質增效的重要手段。在最近的研究中，李倩等［3］報道了一種微生物制劑的使用可以顯著增加土壤細菌、放線菌、自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌的數量，從而提高了土壤脫氫酶、脲酶和蔗糖酶活性，并對煙草土傳病害有一定防效。另一項研究表明，施用復合微生物菌劑、腐熟劑和溶磷劑能顯著提高烤煙的農藝性狀，上等煙比例、畝產量、畝產值均顯著增加，其中產值增加可達32%以上［4］。在其他作物中，復合微生物制劑也同樣起到了顯著效果。麻耀華等［5］對不同生育時期的黃瓜施入復合微生物制劑，根際土壤細菌和放線菌的數量明顯增加，土壤脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶活性提高了一倍以上。由此可見，篩選和開發復合微生物制劑是一種行之有效的措施。本研究前期已篩選了大量煙草根際微生物，現通過對效果良好的菌株進行復合篩選和評價，以期獲得兼具土壤調節和防病促生的復合微生物制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草品種

采用生產主栽品種云煙99。

1.1.2 微生物菌種

采用實驗室從北京、云南等地分離保存的根際益生菌芽孢桿菌S711（Bacillussp.）、假單胞菌S1130（Pseudomonassp.）、鞘氨醇菌S1191（Sphingobiumsp.）和不動桿菌S1063（Acinetobactersp.）。由S711、S1130、S1063制備復合微生物制劑T1，由S711、S1130、S11191制備復合微生物制劑T2，活菌含量均為1×109cfu/mL。

1.1.3 拮抗、解磷、解鉀、產酶和生長素檢測

對煙草致病疫霉（Phytophthora nicotiana）的拮抗采用對峙培養法［6］。其他功能檢測參考文獻［7-10］。

1.1.4 試驗設計

試驗設3個處理，每個處理3個重復，分別施用復合微生物制劑T1、T2為處理組，每盆加入終濃度為1×108cfu/g的復合微生物制劑，攪拌均勻，以不施入復合微生物制劑為對照（CK）。移入煙草苗，待4周后傷根接種10 mL 1×106cfu/mL的煙草致病疫霉，15 d后檢測記錄結果。

1.2 測定方法

1.2.1 土壤酶活性測定

土壤酶活性測定方法參考已發表論文并作部分改進［11-14］。土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定，以每克土24 h產生的NH3-N毫克數表示；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，以每克土24 h產生的葡萄糖毫克數表示。過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4毫升數表示。根際土壤呼吸強度由便攜式土壤呼吸分析儀SRS-SD1000測定。采用氯仿熏蒸浸提法提取土壤微生物量碳和微生物量氮，采用K2Cr2O7氧化法測定浸提液中的微生物量碳，采用凱氏定氮法測定微生物生物量氮。利用土壤微生物基礎呼吸與微生物量碳的比值計算土壤微生物代謝熵（qCO2）。

1.2.2 病情指數與防治效果

參照煙草病蟲害分級及調查方法［15］，計算病情指數和防治效果。

病情指數＝100×Σ（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）

防治效果（%）＝（對照病情指數-處理組病情指數）/對照病情指數×100

1.3 數據統計

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，Duncan’s進行差異顯著性分析，不同處理間顯著差異水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的有益生物學功能

首先對供試菌株進行全面的有益功能檢測，結果如表1所示。S711與S1130均對煙草致病疫霉具有顯著的抑制作用，而S1191與S1063無此功能。S711無解有機、無機磷、產嗜鐵素和生長素的能力，但是該菌株具有很強的產氨、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力。S1130與S711相比，雖不產酶但其解鉀、產嗜鐵素和生長素能力顯著，并具有一定的有機磷分解能力。S1063與其他菌株相比具有突出的分解有機磷的能力，而S1191表現出多種功能，如分解有機磷、無機磷、解鉀、產嗜鐵素、產氨和生長素以及蛋白酶等特性。由此可見，本研究所采用的菌株具有功能多樣性，各自具有獨特的有益功能，可以作為復合微生物制劑的備選。

表1 菌株功能特性

2.2 土壤酶活性

兩種復合微生物制劑（T1、T2）的施用不同程度上影響了根際土壤脫氫酶、脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶的活性（表2）。復合微生物制劑T1雖然對土壤酶活性有一定提高，但其作用顯著低于復合制劑T2。尤其過氧化氫酶的活性，T2處理后顯著高于對照和T1，而T1對土壤過氧化氫酶無顯著影響。復合微生物制劑T2的施用對脲酶和蔗糖酶活性的提高最為顯著，其值分別達到1.68和30.32 mg/（g·d）。由此說明制劑T2對調節土壤營養供給具有顯著效果。

表2 復合微生物制劑對土壤酶活性的影響

2.3 土壤微生物活性

由于復合微生物制劑的施用提高了土壤酶活性，因此推測土壤微生物的活性可能也受到了影響。從圖1來看，T1和T2均顯著提高了土壤微生物量碳、氮和土壤呼吸強度。且T2對土壤微生物活性的影響顯著高于T1。從微生物代謝熵值可以發現，T1處理沒有顯著變化，而T2顯著降低了土壤微生物代謝熵。由此推斷復合微生物制劑改善了煙株根際土壤環境，微生物生長與代謝增強。

2.4 黑脛病防治效果

本研究所選用的有益微生物具有多種生防特性，由此檢測了各復合制劑對煙草黑脛病的防治效果。接種煙草致病疫霉后15 d，對照病情指數達到了73.2%，而施用復合微生物制劑的處理均顯著降低了發病率。復合微生物制劑T1處理的煙草黑脛病指數為56.6%，防效僅為22.7%；制劑T2處理后黑脛病指數低于20%，僅為17.3%，防效顯著高于T1，達到76.4%，且經過3次獨立重復后防效穩定。因此，復合微生物制劑T2具有明顯的煙草黑脛病防治功能。

表3 復合微生物制劑對煙草黑脛病的防治效果

3 討論與結論

土壤是植物生長的根基，土壤質量是植物健康生長的重要保證。良好的土壤環境可以增強微生物代謝活動，提高呼吸強度，降低代謝熵，促進碳氮源的利用率。許多土壤有益微生物可通過分泌土壤酶、參與有機質降解和驅動養分循環，改善土壤的理化及生物學性質，并通過拮抗、寄生及溶菌等作用抑制有害病原菌的侵染和繁殖，促進植物健康生長，進而提升作物產量和品質［16-19］。本研究采用了能夠拮抗病原菌、產酶、解磷、解鉀、產嗜鐵素和生長素的菌株，通過對優良菌株的組合使用，改善了土壤環境，降低了煙草黑脛病的發生，實現了多功能互補。

拮抗作用是目前病害生防菌篩選中的首選指標，也是次生代謝產物中抑制病原菌生長最直觀、最簡便、最有效的因素［20］。本研究中的S711和S1130均具有非常強的抑制煙草致病疫霉的作用，因此在兩種復合微生物制劑中均同時使用了這兩株菌。其中S711屬于芽孢桿菌，此類菌代謝廣泛，可產生多種抗生素、抗菌肽和水解酶，其根部定殖和環境適應性強，是農業生產中生物農藥和微生物肥料的主成分。S711菌株具備芽孢桿菌特有的拮抗病原菌的能力，以及產氨、產蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力。S1130屬于假單胞菌，這類細菌營養需求簡單，在自然界中廣泛存在。尤其在植物根際部分，所篩選到的具有生防活性的細菌絕大部分屬于假單胞菌屬，代表菌株如P.aureofaciens30-84，P.fluorescensCHA0，P.kilonensisF113，P.fluorescensQ2-87，P.fluorescensPf-5等［21-23］。假單胞菌作為生防菌有其自身的優勢，它所產生的次生代謝產物種類較多，在植物根圍中可以被植物選擇性的利用。另外，假單胞菌具有很強的根部定殖能力，很多菌株可產生刺激植物生長的激素，本研究中S1130即可產生植物生長素。復合微生物制劑T1和T2的區別在于第3個菌株的選擇，T1選用了S1063，而T2選用了S1191。S1063屬于不動桿菌，該菌株具有顯著的降解有機磷的能力，以及一定的無機磷降解和產氨、產嗜鐵素的能力。S1191屬于鞘醇屬，除了具備S1063的有益功能外，還具有顯著的產嗜鐵素、蛋白酶和生長素的能力。嗜鐵素是一種低分子量但對三價鐵高親和性的螯合物，可以將鐵運輸到細菌細胞內。嗜鐵素造成的鐵缺乏環境會阻止真菌孢子的萌發，這種有效的鐵吸收機制可能是這些菌株能夠與其它微生物競爭而在植物根部有效定殖的重要原因［24］。復合微生物制劑T2中所特有的產水解酶和生長素特性也可能是其改善土壤環境、防治病害的重要因素。已有研究表明，有益微生物產生的蛋白酶、纖維素酶、幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶等真菌細胞壁水解酶在與病原菌相互作用中發揮重要的作用，可對病原菌孢子萌發、芽管伸長和菌絲生長有強烈的抑制作用［25-26］。

綜上所述，利用復合微生物制劑可以達到改善土壤性質和防治病害的目的。本研究通過對有益微生物篩選和組合后創制的復合微生物制劑T2顯著提高了土壤酶和微生物活性，降低了煙草黑脛病的發病率和病情指數，具有潛在改良土壤和防治土傳病害的開發價值。