中藥巴戟天中多糖含量的快速測定方法研究

蘇明偉，張 蕾，陳語炘

(湖北第二師范學院 化學與生命科學學院，武漢 430205)

巴戟天屬于茜草科植物，其根莖為我國傳統名貴南藥，亦可作為保健品食用，具有抗衰老、抗腫瘤、抗骨質疏松、增強記憶及增強免疫力等多種功效[1-2]，其炮制方法有巴戟肉、鹽巴戟天、藥汁制巴戟天和酒制巴戟天[3]。現代研究表明巴戟天含有糖類、蒽醌類、環烯醚萜類、有機酸類、氨基酸和甾醇類等多種成分[4-6]，其中多糖被認為是促進免疫功能、抗骨質疏松的活性物質[7-8]，是巴戟天檢測的重要指標之一。巴戟天多糖的測定，目前尚未見國家標準或行業標準方法，文獻報道的方法主要有苯酚硫酸分光光度法[9-11]和蒽酮硫酸分光光度法[12-13]，其中樣品的制備通常采用烘干后粉碎的方式，預處理采用兩步加熱回流的方式提取多糖，操作繁瑣、時間較長，不利于基層的推廣。本文以鹽巴戟天為研究對象，提出以液氮粉碎為制備方法，以超聲提取為預處理手段，開發了一套快速測定巴戟天中多糖含量的方法，為企業監控產品質量、篩選優質產品提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

共10個批次鹽巴戟天樣品，其中4個批次由無限極中國有限公司(廣東)提供，5個批次分別購置于安國市聚藥堂藥業有限公司(廣東)、廣西仙茱中藥科技有限公司、康美藥業股份有限公司(廣東)、蘇州市天靈中藥飲片有限公司和四川新荷花中藥飲片股份有限公司，1個批次由本課題組用巴戟天為原料自制，均為2017～2018年生產，分別編號為1～10號。

1.2 儀器及設備

TU-1950紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；KX-100高速粉碎機：武漢鼎藏日用金屬制品廠；ME104E分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHZ-D(III)循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市新航儀器廠；QYZH-20A超純水儀：重慶前沿水處理設備有限公司。

1.3 試劑與溶液的配制

葡萄糖標準品：阿拉丁工業公司(上海)；無水乙醇、苯酚、濃硫酸：均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

葡萄糖標準儲備液(1.000mg·mL-1)：精密稱取干燥后的葡萄糖標準品0.1000g，溶于少量水中并轉移至100mL容量瓶中，加入0.5mL濃鹽酸防止微生物生長，加水定容至刻度；葡萄糖標準使用液(0.1000 mg·mL-1)：將葡萄糖標準儲備液稀釋10倍，使用當天配制；苯酚溶液(5%)：將苯酚瓶置于60℃水浴中熔化，然后移取5.00g于燒杯中，加水溶解并轉移至100mL容量瓶中定容搖勻。

1.4 樣品的制備

取一定量(約50g)鹽巴戟天樣品于高速粉碎機中，加入30mL液氮，立即快速封蓋并高速粉碎30s，打開拌勻后，重復加液氮再粉碎一次，裝入具塞寬口瓶中備用。

1.5 多糖的提取

超聲提取(本法)：精密稱取0.50g樣品粉末置于100mL錐形瓶中，加入70mL 80%乙醇溶液，60℃下超聲提取30min，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次8mL，棄去濾液。濾渣連同濾膜置于錐形瓶中，再加70mL純水60℃超聲提取30min，濾紙抽濾過濾，濾渣用熱水洗滌3次，每次8mL，收集水提液并冷卻定容至100mL，即得待測溶液。

加熱回流提取(對照法)：精密稱取0.50g樣品粉末置于250 mL圓底燒瓶中，加入150mL 80%乙醇溶液，于90℃水浴中回流1h，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10mL，棄去濾液。濾渣連同濾膜放回圓底燒瓶中，再加150mL純水于90℃水浴中回流1h，濾紙抽濾過濾，濾渣用熱水洗滌3次，每次10mL，收集水提液并冷卻定容至250mL用來測定多糖含量。

1.6 標準曲線的繪制

分別吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL葡萄糖標準使用液于25mL比色管中，各加水至2.00mL，再各加5%苯酚溶液1.00mL，搖勻，再垂直快速加入濃硫酸5.00 mL，搖勻并放置5min，置40℃水浴中20min，取出冷卻至室溫，以試劑空白為參比，于490nm波長處測量吸光度。以葡萄糖濃度c(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線并擬合回歸方程。

1.7 樣品測定與結果計算

分別取上述1.5超聲提取或加熱回流提取的水提液1.00mL于25mL具塞比色管中，按1.6步驟測定吸光度，代入標準曲線方程并計算出樣品中的多糖含量，以質量分數計(單位mg·g-1)，其中葡萄糖換算為多糖的換算因子為0.9。

2 結果與分析

2.1 測定波長的確定

吸取一定量葡萄糖標準使用液于具塞比色管中，按照1.6步驟顯色，以試劑空白為參比于紫外可見分光光度計上掃描吸收曲線，結果見圖1。由圖1可知，顯色生成物的最大吸收波長為490nm，因此確定以490nm為最佳測定波長。

圖1 苯酚硫酸法測定葡萄糖的吸收曲線

2.2 標準曲線方程

按照1.6標準曲線的繪制步驟進行操作，以試劑空白為參比于490nm波長處測量吸光度并繪制標準曲線。可得苯酚硫酸法測定葡萄糖的回歸方程為A=63.183c+0.0062，R=0.9998，可見在0～0.0125 mg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.3 樣品的制備研究

常規的樣品制備程序一般是先將巴戟天樣品烘干 (限定60℃[14]) 后，再粉碎過篩(60目)。實驗中發現該過程不僅非常費時，且樣品粉末在過篩時非常容易吸收空氣中的水分，會導致誤差的出現。而中藥企業在藥材成品的常規檢測過程中一般可以對藥材中微量水分的影響忽略不計的，但若樣品不經烘干直接粉碎，部分樣品在粉碎時會因溫度急劇升高而粘連在一起難以過篩，因此本研究擬不對樣品進行烘干處理，嘗試直接對原樣進行加液氮粉碎處理并比較粉碎次數對多糖測定結果的影響。

具體操作參見1.4樣品的制備，結果表明，加入液氮后樣品的粉碎效果比較理想，粉碎后顆粒較均勻分散，溫度較低不易粘連在一起，粉碎次數越多，顆粒越小越均勻。不同粉碎次數對多糖含量(超聲提取檢測)及水提液過濾時間的影響見圖2所示，隨著粉碎次數的增加，多糖測定值逐漸減小，但粉碎3次與2次的結果相差不大，而3次時顆粒很細導致后續水提液過濾比較困難，綜合考慮最終確定樣品加液氮粉碎2次30s為最佳制備方案。

圖2 粉碎次數對多糖含量及水提液過濾時間的影響

2.4 超聲提取條件的優化

超聲萃取技術是近年來發展起來的一種新型分離技術，具有快速、安全、高效等特點，被廣泛用于中藥材提取的研究[15]。但目前超聲用于巴戟天中多糖含量測定的研究鮮有報道，因此本研究嘗試用超聲提取進行巴戟天樣品的預處理。

實驗首先比較了超聲提取溫度對多糖測定結果的影響，因超聲儀水槽的最高設定水溫為60℃，因此比較了20℃、40℃與60℃的影響，發現溫度越高，多糖測定值越低，而60℃的結果更接近加熱回流提取(對照法)的數值，其原因可能是較高溫度下醇提更易去除單糖和低聚糖的干擾，因此確定超聲提取的最佳溫度為60℃.

在最佳溫度下比較了兩步(醇提+水提，參見1.5)超聲提取時間對結果的影響，結果表明兩步提取時間均為30 min或60min 時樣品中多糖的檢測結果沒有明顯差異，說明超聲提取多糖的主要影響因素是溫度而非提取時間，因此確定兩步超聲提取的最佳時間均為30 min。

2.5 超聲提取與加熱回流提取的比較

因巴戟天中多糖的測定(含預處理)沒有國家標準方法可供參考，因此本研究采用文獻報道較多的加熱回流提取法作為對照法與超聲提取法進行比較，試圖找出超聲提取與對照法的關聯。

對10個樣品進行液氮粉碎制備后分別采用上述最優超聲提取法和加熱回流提取法進行樣品預處理并均用苯酚硫酸法測定多糖含量，重復測定三次，計算平均值和相對標準偏差，結果見表1所示。可見，總體上超聲提取與加熱回流提取的精密度之間差異不大，但相同樣品的超聲提取法測定結果明顯高于加熱回流法，這可能與兩個方法的溫度差異有關，也可能與超聲的空化效應能快速破碎細胞壁有關。同一提取方法測得不同廠家樣品的多糖含量高低不同，其中5號樣品多糖含量遠高于其它樣品，具體原因不詳。

表1 超聲提取與加熱回流提取巴戟天中多糖的比較

續表1

將兩種提取方法的多糖測定均值進行線性擬合，結果見圖3所示，擬合公式為y=0.3321x+5.7767，x代表超聲提取測定結果，y代表加熱回流提取結果，R2=0.6797，線性相關系數R=0.8244，說明兩種提取方法之間有比較明顯的相關性。

圖3 超聲提取結果與加熱回流提取結果的擬合

若將超聲提取測定值用擬合公式換算成加熱回流對應值，并以加熱回流提取的實驗值為標準值計算相對誤差，具體結果見表2。由表2可知，10個不同樣品的超聲提取測定值經換算后，與加熱回流法測定值的相對誤差均小于10%，準確度上滿足快速檢測的要求。

3 結論

本文以鹽巴戟天為研究對象，建立了一套快速測定巴戟天中多糖的方法，首次將液氮粉碎和超聲提取用于巴戟天的檢測過程，實現了從制備到提取到檢測過程的快速化。本法操作簡便、快速，單個樣品測定時間約為3h，相對于傳統的樣品烘干粉碎-加熱回流提取-苯酚硫酸法檢測過程(約需12h)，時間上縮減了約3/4，且一臺超聲儀可以同時提取6個樣品，大大提高了工作效率，適用于企業大批量檢測篩選優質產品。本法精密度好，結果可靠，其多糖測定結果可以直接作為企業的產品質量依據，也可以通過擬合公式換算為傳統的加熱回流提取法的對應結果。

表2 超聲提取換算結果與加熱回流提取結果的比較