微生物-物化耦合法降解毒死蜱研究進展

侯 俊，王巖博，張 明，蘭 林，許 伊，徐余潔

(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.河海大學環境學院， 江蘇 南京 210098； 3.河海大學水利水電學院，江蘇 南京 210098；4.江蘇省水利廳，江蘇 南京 210029)

農業是我國國民經濟的基礎，為了保證糧食增產、農民增收與維護社會穩定，農藥被廣泛應用于現代農業生產中，其中有機磷農藥是全球范圍內使用量最大的農藥之一[1]。毒死蜱(chlorpyrifos, CP)是一種高效廣譜有機磷殺蟲劑和殺螨劑，被廣泛用于各種農作物除蟲防治和衛生安全等領域。自1965年問世以來，CP在世界范圍內的應用越來越廣，尤其受發展中國家的青睞，一方面因為它沒有類似甲胺磷、氧樂果等農藥的劇毒性，另一方面它的成本較低。然而，長時間的過量使用導致CP在環境中的殘留量發生累積，河流中檢測出的CP質量濃度高達4.3 μg/L，該濃度將對水生生物產生毒性作用[2]。CP的生物毒性作用機理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性[3]，導致神經傳導無法正常進行，進而引起癱瘓抽搐等病理現象。CP對人的心腦血管及呼吸系統具有一定的影響，嚴重者致死。CP降解的主要代謝產物之一3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)的毒性遠高于其母體化合物的毒性[4]，目前部分歐美國家已在某些領域全面禁止使用CP。中國農業農村部宣布于2017年1月1日起在蔬菜上禁止使用CP，但在水稻、小麥、棉花等作物栽培上CP仍被大量使用。CP具有長達數百天的半衰期，在自然狀態下很難在短期內完全降解[5]。因此，一直以來CP的降解是一項受到廣泛關注的研究課題。

單一的CP降解方法往往存在一些不足，如傳統的生物法存在對CP降解效率低、作用時間長、穩定性較差等問題；而化學法又存在成本高、條件苛刻、運行維護復雜等不足。近年來，眾多學者提出的微生物-物化耦合法在降解效率和運行穩定性方面可以彌補單一降解方法存在的種種不足，具備安全、高效、經濟、簡便等多重優點。針對微生物分別與電化學、零價鐵(zero valent iron, ZVI)、植物及光催化法耦合降解CP的研究，從系統運行效率和運行條件等方面進行綜述，如表1[6-11]所示，直觀地對比上述幾種方法的降解效果，為提升CP降解效率的研究提供科學依據。

表1 微生物-物化耦合法降解CP的效果

1 微生物耦合電化學法降解CP

利用微生物法去除水體中污染物具有操作簡單、工藝較成熟、運行成本低等優點[12]，但同時也存在降解效率低、作用時間長、對高濃度CP的耐受性差等不足；電化學法具備反應速度快、去除效率高等優點，但也存在成本高、有機物礦化程度低等局限[13]，因此眾多研究者開始引入微生物耦合電化學的方法來降解CP。

鐵碳微電解是一項基于原電池的技術，該技術以氧化還原、吸附、共沉淀及微電場富集效應去除水中的污染物[14]，其作用機理主要是電解質溶液中鐵碳間存在電勢差，由電勢差形成無數個微小原電池[15]，利用原電池的電化學效應降解污染物。涂立俊[6]研究鐵碳微電解耦合人工濕地系統對CP的降解效率時表明，當進水CP的質量濃度分別為0.147 mg/L、0.182 mg/L、0.271 mg/L時，由于鐵碳微電解作用，耦合系統較傳統人工濕地系統對CP的降解效率分別提高了7.7%、4.7%和4.6%。耦合系統內填入的基質鐵碳除了利用原電池的電化學效應提高對CP的降解效率外，還可以通過吸附作用去除部分CP。鐵碳基質具有較大的孔隙率和比表面積，與普通人工濕地相比，能夠吸附更多的CP。鐵碳微電解還能為微生物提供附著位點，改變微生物群落組成，激活微生物活性[16]。鐵碳微電解耦合人工濕地的優勢變形菌為Proteobacteria，該菌可氧化氨氮，降解CP等復雜污染物，耦合系統的高通量測序結果表明其相對豐度為83.3%(傳統人工濕地為52%)。此外，能夠分解殺蟲劑和除草劑的優勢菌株Flavobacteriaceae，耦合系統高通量測序的相對豐度為6.0%(傳統人工濕地為1.1%)。另外，郝艾波[7]在研究電化學耦合人工濕地系統對CP的降解特性時發現脲酶、堿性磷酸酶等酶活性顯著高于傳統人工濕地系統，且隨著其他農藥的投入，耦合系統仍具有較高的酶活性。適宜的電場不僅通過氧化還原反應降低CP對微生物的毒害作用，還能通過提高降解酶的活性激發微生物對CP的降解。

2 微生物耦合ZVI降解CP

傳統活性污泥法去除CP常常需要外加甲醇作為補充碳源，并定期進行排泥處理，因此大大提高了活性污泥系統降解CP的運行維護成本，并且該工藝受溫度、pH等環境因素的影響導致系統出水不穩定。ZVI廉價易得且強化反硝化的效果明顯[17]，在環境污染原位修復工作中取得了一定的進展，因此微生物耦合ZVI降解CP受到關注[18-20]。

2.1 降解作用機理

微生物降解CP的機理主要是共代謝和礦化作用。共代謝作用中，微生物不以CP作為唯一碳源，需從其他底物獲得營養；礦化作用是CP完全脫毒的過程，微生物以CP作為唯一的碳源。一般情況下微生物降解CP的途徑是進行堿性水解反應生成TCP和O,O-二乙基硫代磷酸酯(DETP),如圖1所示。TCP降解途徑因菌株不同而有所差別，主要是烷基化反應和脫氯反應，反應終產物為二氧化碳。DETP降解途徑是其作為碳源被微生物分解成H3PO3和乙醇[21]。ZVI還原污染物是一個多步化學腐蝕的過程。在Fe-H2O體系中還原劑主要是ZVI、Fe2+、H2。Fe2+還原速度慢且數量有限，H2只有在合適催化劑作用下才具有較好的還原性[22]，因此在Fe-H2O體系中起還原作用的主要是ZVI表面直接轉移的電子。Hou等[8]研究表明在最佳初始反應條件下，微生物耦合ZVI系統與傳統活性污泥系統去除CP的效率分別為95.94%和79.97%，產生TCP的質量濃度分別為213.23 μg/L和253.84 μg/L。Zhang等[23]研究表明微生物耦合ZVI系統對CP的降解效率從第1天的73.17%迅速增加到第7天的95.19%并趨于穩定；單獨微生物系統對CP的降解效率穩定在80%左右；單獨ZVI系統對CP的降解效率不穩定，大多為86%。

圖1 CP堿性水解

圖2 微生物與ZVI的協同作用

微生物耦合ZVI系統強化去除CP時，ZVI的還原作用不能使CP完全礦化，但難以生物降解的污染物可通過ZVI還原作用及鐵離子與鐵氧化物的絮凝、吸附、沉淀作用[24-25]轉化為易生物降解污染物或直接從水體中去除，大大降低CP對微生物的毒性。上述過程不僅提高了耦合體系內微生物的物種豐富度，而且激發微生物高效持續降解CP的能力，此外，ZVI還可通過刺激微生物產生胞外物質來提高對污染物的降解效率。Zhang等[23]研究表明ZVI可通過降低反應容器的氧化還原電位(ORP)為專性厭氧菌提供適宜的厭氧環境，并且ZVI可提高微生物群落FDX、F420等關鍵酶的含量，從而提高CP的生物降解效率。另外，微生物耦合ZVI系統中微生物可緩解ZVI鈍化的問題，長久保持其正常運行的活性。張揚等[26]研究表明微生物耦合ZVI系統初始水溶液pH在6.8～6.9之間(厭氧生物處理的水溶液pH在6.6～6.7之間)，可有效抑制反應過程中ZVI因pH升高而鈍化失活。微生物與ZVI的協同作用如圖2所示。

2.2 微生物-ZVI耦合系統緩解ZVI鈍化

隨著微生物耦合ZVI系統的運行，ZVI表面氧化加重構成鈍化層，阻礙電子與CP之間的傳遞，導致系統反應速率下降，嚴重影響CP的去除效率，因此有效解決ZVI的鈍化現象是該領域研究的熱點問題。萬莉等[27]采用電增強零價鐵(EEZVI)強化厭氧氨氧化(anammox)技術，通過外加直流穩定電源的方法，促進ZVI表面電子的遷移，抑制ZVI表面的鈍化。近年研究表明異化鐵還原菌(dissimilatory iron reducing bacteia, DIRB)能提高鈍化氧化鐵的活性，因此用異化鐵還原菌耦合鈍化ZVI降解CP逐漸成為一種解決ZVI鈍化的新思路[28]。超聲波和酸化技術也能夠有效抑制ZVI的鈍化，二者結合可去除99%的鐵鈍化膜[29]。此外，采用具有比表面積大、表面活性高、遷移性能良好的納米鐵技術(粒徑在1～100 nm)、Pd/Fe、Ni/Fe、Mg/Fe、Pt/Fe等雙金屬技術也可有效抑制ZVI的鈍化[30]。綜上所述，今后研究者在采用微生物耦合ZVI法去除CP時要融入抑制ZVI鈍化的技術，從而進一步提高降解CP的效率。

3 微生物耦合植物降解CP

李法云等[31]研究表明有機污染物的降解是多種酶分步作用的結果，導致污染物在微生物作用下會出現沒有徹底降解，甚至轉變成毒性更強的中間產物的現象，這與生物修復污染物的宗旨相違背。此外，微生物的生長受營養、代謝等多方面的制約，微生物降解污染物的效率較低。因此，眾多研究者引入微生物-植物根系耦合法降解污染物。

3.1 微生物耦合植物技術

目前研究者采用微生物耦合植物去除污染物時，使用最廣泛的是人工浮島和人工濕地技術。人工浮島技術是利用生物浮島將植物與微生物耦合修復水體污染物的無土栽培技術，其原理是把高等植物種植在塑料基盤上，植物根部直接接觸水面，利用植物與根部微生物的協同作用來降解CP[32]。人工濕地技術是一種人工構建濕地環境去除污染物的技術，主要原理是利用微生物、植物、基質的協同作用降解污染物，包括過濾、吸附、沉淀、離子交換、微生物分解、轉化、氧化分解等方法。采用人工濕地技術去除污染物較傳統污泥法操作簡便且成本與維護費用較低[33]。

3.2 降解作用機理

姚夢琴[34]研究表明當CP初始質量濃度為 40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L時，微生物耦合黑麥草較單一黑麥草系統降解CP的效率分別高24.98%、14.49%、10.64%。一方面，植物根部可以為微生物生長提供場所，植物通過光合作用在根部形成氧化微環境，促進微生物的生長與繁殖，此外，植物能改善溫度、濕度、pH值等環境因素，進而改善微生物的生存環境；另一方面，微生物降解CP降低了污染物對植物的毒害作用，提高了植物的耐受性。對于污染物中難降解的部分，微生物能夠改變其形態，利于植物的吸收利用[35-36]。唐小燕[37]在研究復合回流人工濕地系統對CP的降解機制時，采用單體同位素(CSIA)對CP的碳同位素組成進行標記，在48 h內微生物耦合風車草與單獨微生物系統碳同位素分餾較少，在72 h后兩個系統δ13C總濃度開始增加，耦合系統增加更為明顯。從CP和TCP濃度變化的角度分析，在48 h內CP濃度大大降低，TCP濃度急劇增加；72 h后兩個系統TCP濃度開始降低，耦合系統降低更為明顯。唐小燕[37]認為δ13C值的顯著變化直接反映出CP的降解途徑，并直接證明植物能有效提高CP在復合人工濕地系統的降解。唐小燕[37]進一步運用瑞利方程建立碳同位素比與CP殘留濃度之間的關系，同位素效應(AKIE)與親核取代反應C-O鍵斷裂相吻合，進一步證實濕地系統CP的降解機理首先是C-O鍵的斷裂，主要中間產物為TCP。該研究還通過高通量測序分析了有無植物對復合回流人工系統微生物群落的影響。在植物-微生物耦合系統內OTUs、Chao1指數和Shannon指數分別為1 595～1 742、2 258～2 564和7.41～7.64，顯著高于單獨微生物系統的1 183～1 431、1 879～2 072和5.97～6.84。上述數據直觀表明植物可以提高微生物的豐度和多樣性，從而提高微生物對CP的降解效率。

4 微生物耦合光催化降解CP

微生物法降解CP的缺點之一是周期比較長，一般菌種降解50 mg/L的CP需要96 h[38]。光催化技術降解CP具有周期較短的優勢[39]，但其降解CP的有效質量濃度一般低于50 mg/L，最適濃度在1～10 mg/L[40]。因此研究者為了尋求更加高效省時降解CP的方法，開始深入研究微生物耦合光催化對CP的降解效果。

光催化技術產生于1972年[41]。當采用紫外線催化技術去除CP時，磷酸鹽酯發生裂變，優先釋放出三氯吡啶醇，三氯吡啶醇進一步發生光脫鹵和氧化環裂解反應[42]。光催化與生物降解直接耦合技術(intimate coupling photocatalysis and biodegradation， ICPB)是2008年Rittman教授課題組首次提出的概念[43]，如圖3所示，其中耦合系統去除污染物的關鍵技術是構建出光催化材料與微生物的復合載體。在ICPB系統啟動初期，載體外表面的生物膜在水流剪切力等作用下脫落而暴露出光催化劑，載體內部的生物膜由于載體特殊的結構形式沒有被破壞。當紫外燈光照射時，載體外表面的光催化劑會產生具有強氧化性的含氧自由基，含氧自由基將CP降解為中間產物。其中一部分中間產物可以被內部的生物膜徹底礦化成CO2和H2O，其余不可被微生物降解的中間產物繼續由光催化降解[44-46]。王其進[10]利用微生物法降解CP運行81 h后，引入光催化技術再耦合作用 6 h后發現CP被徹底去除，比單獨微生物固定化酶降解CP節約12.1%的時間，降解效率提高5倍。金成[11]通過研究推斷光催化耦合微生物系統降解CP是一級酶促反應，優先破壞的是P-O鍵。光催化耦合微生物系統提高了CP可降解的初始濃度，并有效縮短了CP的降解時間。目前的研究僅對光催化耦合微生物降解CP的內在機理進行了初步探討，對降解的傳質動力學模型還有待進一步的研究。

圖3 ICPB技術降解TCP

5 結論與展望

5.1 結論

對微生物耦合電化學、ZVI、植物及光催化降解CP的去除效果、耦合機理及強化去除機制等方面進行了綜述，結果表明，微生物與生物、化學技術的協同作用能夠彌補單一體系降解CP過程中存在的不足，進而使CP和中間產物TCP在耦合系統中的去除效率明顯高于單一的生物或化學系統，同時具備安全、高效、經濟、簡便等優點。綜合來看，微生物耦合光催化系統對CP的去除效率顯著高于其他幾種耦合方式，但受限于光催化技術嚴格的運行條件，目前在實際應用方面還具有一定的局限性。微生物耦合ZVI系統對CP的降解效率較高、作用時間短且運行能耗低，成為最具應用前景的環境友好型CP處理技術。微生物耦合植物系統對CP的降解效果較單一體系雖然也有所提高，但所需處理時間長且最優植物的選取與大面積栽培存在一定的難度，因而在大范圍推廣應用方面存在一定的局限性。

5.2 展望

利用微生物-物化耦合法降解CP是降低田間殘留CP和保證農產品質量安全的有效措施之一，深入剖析各種耦合方法去除CP的效果和內在作用機理，將為土壤和農產品中CP的殘留控制技術提供科學依據。根據現有研究基礎，今后利用微生物-物化耦合法去除CP的主要研究方向有：

a. 微生物耦合植物系統最優植物的選擇與土壤生物基因庫中降解性功能菌的篩選與保護。應廣泛篩選能夠高效率降解CP的菌株及與其耦合效果明顯的植物，并通過生物、載體等技術，提高它們在復雜環境中的存活率與穩定性。

b. 微生物耦合光催化系統及微生物-光催化復合載體的合理選擇與優化設計。應加強微生物光催化機理的深入研究，準確定位對CP降解起關鍵作用的酶基因序列，并做出穩定高效的微生物光催化復合載體。此外，光催化反應器使用紫外燈作為光源僅停留于實驗室階段，如何擴大規模運用到田間還有待進一步的研究。

c. 擴大微生物耦合化學法去除CP的開發與生產，盡早攻克酶制劑固定化、快速處理、批量生產等難題，滿足農業生產的需求。

d. 多數試驗研究耦合降解單種農藥，而現實生活中面源污染常為混合農藥，故應擴大研究微生物-物化耦合方法對混合農藥的去除。

e. 微生物耦合系統降解CP的內在機理及降解動力學的研究還不成熟，有些研究領域對CP的降解機理僅做了初步的探討，因此準確掌握CP降解的內在機理及降解動力學還面臨著巨大的挑戰。