Semaphorin 4A在免疫系統中的調節作用及機制①

張曉君 文瑞婷 楊志剛（廣東醫科大學附屬湛江中心人民醫院血液風濕內科，湛江524045）

信號素（Semaphorins，Sema）家族是一類具有特異性細胞外“Sema”結構域的蛋白質家族，包括分泌型蛋白、細胞表面蛋白和膜結合蛋白，目前已有30余種Sema被鑒定，可分為8個亞家族［1］。Semaphorin 4A（Sema4A）屬于Sema家族成員，主要表達于樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和B細胞，通過與其受體結合發揮生物學作用［2］。Sema4A有7種功能受體：Plexin D1，Plexin B1-3，T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域-2（T cell immunoglobulin-and mucin-domaincontaining molecule-2，Tim-2）、神經纖毛蛋白（neuropilin-1，NRP-1）及最新發現的免疫球蛋白樣轉錄物4（immunoglobulin-like transcript 4，ILT-4）［3-4］。最新研究表明，Sema4A與其受體相互作用參與T細胞、DCs及巨噬細胞等免疫細胞的功能調節過程，且在自身免疫性疾病和腫瘤發生發展中發揮重要作用［5］。深入了解Sema4A的免疫調節功能及其在疾病中的作用有望為以Sema4A為靶點的免疫治療提供新思路。因此，本文就Sema4A的免疫調節功能及其在自身免疫性疾病和腫瘤中作用的最新研究進展進行綜述。

1 Sema4A的結構與受體

Sema4A是一段長761 AA，分子量為150 kD的糖蛋白，其結構從氨基末端（32 AA）依次為Sema結構域和C2型免疫球蛋白樣結構域（651 AA）、疏水跨膜區（21 AA）及胞質尾（57 AA）［2］。Sema4A在包括大腦、肺和淋巴器官在內的多種組織中均有表達。在免疫系統中，Sema4A主要表達于DCs和B細胞表面，也表達于活化的巨噬細胞，在活化的T細胞上也有低水平表達，但不表達于靜息的T細胞［3-5］。Sema4A的受體包括PlexinB1-3、PlexinD1、Tim-2、NRP-1及新發現的ILT-4，通過與不同的受體結合發揮不同的生物學功能［3-4］。

PlexinB1是一段長2 135 AA的糖蛋白，主要表達于胎兒期腦、肺、雌性動物生殖系統、肝臟，而PlexinB2基因位于22號染色體，包含37個編碼外顯子，主要表達于上皮細胞和內皮細胞［6］。最新研究證實Sema4A信號可通過PlexinB1受體促進抑制性突觸發育，通過PlexinB2受體促進興奮性突觸發育［7］。PlexinB2可作為Sema4A在CD8+T細胞上的功能受體，Sema4A/Plexin B2軸通過激活mTOR信號調節CD8+T細胞活化和分化，但具體機制尚未闡明［8］。

Sema4A也表達于內皮細胞，PlexinD1是Sema4A在內皮細胞上的功能受體，Sema4A直接結合PlexinD1在體外抑制VEGF介導的內皮細胞遷移和增殖，并抑制體內胚胎血管生成［9］。表明Sema4APlexinD1軸負向調節VEGF誘導的血管新生，可能在腫瘤發生發展中發揮抗腫瘤作用。此外，Sema4A通過PlexinD1受體可激活Akt通路從而促進肺纖維化，阻斷Sema4A/PlexinD1/Akt級聯反應有望延緩肺纖維化進展［10］。目前關于Sema4A與PlexinD1受體的研究相對較少，其在不同疾病中的作用有待進一步研究。

Tim-2為Tim家族跨膜蛋白，主要表達于活化的T細胞，尤其是Th2細胞，也可表達于B細胞，但在抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）上不表達［11］。研究表明，Sema4A與其受體Tim-2相互作用可促進T細胞活化和分化，Sema4A與Tim-2可作為T細胞的共刺激因子發揮作用［11］。但也有研究認為Tim-2對Th2細胞應答起負向調節作用［12］。因此Sema4A與Tim-2的相互作用對T細胞活化起正向調節還是負向調節作用仍存在爭議。

NRP-1又被稱為CD304和BDCA-4，是一種主要表達于DCs、CD4+T細胞和調節性T細胞（regulatory Tcells，Tregs）的非絡氨酸激酶跨膜多功能蛋白［13］。NRP-1是新近發現的Sema4A在Tregs上的功能受體，Sema4A與Tregs上表達的NRP-1受體結合可通過將磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）募集至NRP-1抑制Akt磷酸化，導致轉錄因子Foxo3a核定位，維持Tregs穩態和功能從而發揮免疫抑制作用［14］。目前關于Sema4A與其受體NRP-1相互作用的研究較少，Sema4A/NRP-1/Tregs軸在免疫系統中的作用有待進一步研究。

2018年，研究發現ILT-4是人Sema4A在活化的CD4+T細胞上的受體［4］。與小鼠不同，人DCs上的Sema4A與CD4+T細胞上的ILT-4受體結合可促進Th2分化和IL-4、IL-5和IL-13產生，抑制Th1分化和IFN-γ產生，從而發揮強大的免疫負調節效應［4］。提示Sema4A/ILT-4軸對免疫系統的負調節作用可能參與機體病理生理過程。因此，進一步研究Sema4A與ILT-4受體在自身免疫性疾病或腫瘤中的作用有望為以Sema4A/ILT-4軸為靶點的治療提供依據。

2 Sema4A的免疫調節功能

2.1 Sema4A與CD4+T細胞 DCs來源的Sema4A與T細胞上的Tim-2受體結合可導致抗原特異性T細胞活化［11］。研究表明Sema4A不僅對T細胞的活化具有重要作用，在調節Th1/Th2細胞的免疫應答方面也發揮重要作用，且Sema4A也表達于Th1細胞，對T細胞分化起重要作用［15］。當小鼠T細胞在Th1極化條件下培養時，Sema4A呈高表達；當T細胞在Th2極化條件下培養時，Sema4A表達水平降低。且研究發現Sema4A缺陷小鼠T細胞可向Th2細胞正常分化，但無法分化為Th1細胞，也不產生IFN-γ。表明T細胞來源的小鼠Sema4A參與Th1細胞免疫應答，是Th1細胞分化的關鍵因子［15］。Sema4A可顯著促進活化的人CD4+T細胞產生細胞因子IL-4、IL-5和IL-13，但IFN-γ生成并未增加，提示人Sema4A與小鼠Sema4A不同，其促進Th2細胞分化而非Th1細胞［4］。當初始T細胞與Sema4A缺陷的DCs共培養時，IL-17生成嚴重受損，表明DCs來源的Sema4A對抗原特異性Th17細胞分化也起重要作用［12］。提示DCs來源的Sema4A與T細胞來源的Sema4A在免疫應答發展過程中發揮不同作用，Sema4A不僅參與抗原特異性T細胞產生，同時對Th1/Th2/Th17細胞分化發揮重要作用。

2.2 Sema4A與CD8+T細胞 最近研究發現Sema4A表達于初始的CD8+T細胞，但不表達于初始的CD4+T細胞，Sema4A通過mTOR通路調節CD8+T細胞活化與分化，敲除Sema4A的CD8+T細胞其細胞因子IFN-γ和TNF-α生成受損，且效應分子顆粒酶B、穿孔素和FAS-L表達顯著減低［8］。Sema4A受體分子中只有PlexinB2表達于CD8+T細胞，敲除PlexinB2的CD8+T細胞產生的IFN-γ顯著減少［8］。提示Sema4A與其PlexinB2在CD8+T細胞參與的病理生理過程中可能扮演重要作用。

2.3 Sema4A與Tregs 傳統T細胞上的Sema4A直接與Tregs上的NRP-1受體相互作用維持Tregs穩定和功能，阻斷Sema4A/NRP-1軸可抑制腫瘤生長［14］。提示Sema4A可能在Tregs介導的腫瘤發生發展中扮演重要作用，Sema4A/NRP-1軸有望成為腫瘤免疫治療靶點。最新研究發現，漿細胞樣DCs來源的Sema4A缺陷可抑制功能性NRP-1+Tregs擴增，表明Sema4A/NRP-1信號對Treg活性和功能促進具有重要作用［16］。

2.4 Sema4A與DCs 在免疫系統中，Sema4A傾向表達于骨髓來源和脾臟DCs［11］。采用抗原負載的DCs研究揭示DCs來源的Sema4A對啟動T細胞免疫應答具有重要作用［15］。此外，可溶性Sema4A蛋白可促進異基因T細胞與DCs的混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR），而抗Sema4A單克隆抗體可阻斷MLR［15］。提示Sema4A通過影響DCs與T細胞的相互作用參與T細胞活化。

2.5 Sema4A與巨噬細胞 Sema4A也表達于活化的巨噬細胞，并在活化的巨噬細胞中Sema4A受體PlexinB2和PlexinD1表達增加［17］。可溶性Sema4A蛋白可以劑量依賴的方式刺激巨噬細胞遷移，抗PlexinD1單克隆抗體可抑制Sema4A對巨噬細胞的遷移作用。Sema4A介導的巨噬細胞在體內外可通過VEGF-A/VEGF-2信號促進血管新生［17］。但與早期研究報道的Sema4A對血管新生具有抑制作用結論相反［9］。仍需進一步研究闡明Sema4A在血管新生中的作用。

3 Sema4A與疾病

3.1 Sema4A與自身免疫性疾病

3.1.1 炎癥性腸病 炎癥性腸病是一種自身免疫性疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）。研究發現CD和UC患者血清Sema4A水平比健康志愿者顯著降低，但血清Sema4A水平降低的原因及機制尚未明確［18］。CD和UC患者腸道組織活檢中發現固有層淋巴細胞中Sema4A呈高表達，提示Sema4A可能在腸道局部組織炎癥調節中發揮重要作用［18］。表明Sema4A參與炎癥性腸病發生，但具體機制有待進一步研究。

3.1.2 中樞神經系統脫髓鞘 中樞神經系統脫髓鞘是以中樞神經系統多灶性及炎癥性脫髓鞘為主的自身免疫系統疾病，免疫激活不當導致髓鞘靶向破壞及成熟髓鞘少突膠質細胞丟失。研究發現，Sema4A作為T細胞活化必需的免疫營養因子，可誘導嚙齒動物少突膠質細胞凋亡［19］。隨后研究證實人類少突膠質細胞在暴露于Sema4A時發生凋亡，H-鐵蛋白可阻斷Sema4A介導的細胞毒性［20］。該研究團隊進一步發現直接向小鼠胼胝體注射Sema4A可導致髓鞘結構喪失和髓鞘減少，同時伴隨成熟髓鞘化少突膠質細胞凋亡［21］。提示Sema4A作為脫髓鞘疾病免疫系統和少突膠質細胞的重要介質參與疾病發生發展。

3.1.3 多發性硬化癥 多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統脫髓鞘性自身免疫性疾病，其病因和發病機制尚未明確，近年研究發現抗原提呈及隨后發生的髓鞘反應性CD4+T細胞活化/分化在MS的發病機制中發揮關鍵作用［22-23］。最近研究表明Sema4A參與MS發病過程，MS患者血清Sema4水平升高，DCs Sema4A表達升高，且CD4+T細胞中Th17細胞比例顯著上升；高水平Sema4A的MS患者病情更為嚴重且IFN-β治療無效［24］。美國FDA批準的用于治療MS的藥物芬戈莫德對高水平Sema4A的MS患者效果良好，且動物實驗證實接受芬戈莫德治療后，接受重組Sema4A融合蛋白注射的實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠疾病嚴重程度得到明顯改善［25］。表明Sema4A通過促進CD4+T細胞向Th17分化參與MS發病過程，有望成為MS病情評估及療效監測的生物學指標。

3.1.4 系統性硬化癥 系統性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）是一種以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征的全身性自身免疫性疾病。研究發現，SSc患者血漿Sema4A水平及外周血單核細胞和CD4+T細胞內Sema4A表達較健康對照者明顯升高，且與皮膚增厚的嚴重程度呈正相關［26］。炎癥因子可明顯誘導SSc患者單核細胞和CD4+T細胞分泌Sema4A。功能實驗顯示，CD3/CD28刺激Sema4A可明顯促進總CD4+T細胞、初始CD4+T細胞及效應CD4+T細胞分泌細胞因子IL-17，并提高IL-17+細胞比例［26］。Sema4A可誘導健康對照者和SSc患者真皮成纖維細胞促纖維化表型，可通過阻斷或沉默Sema4A受體PlexinD1 and PlexinB2表達消除這種作用［26］。表明Sema4A作為Th17產生和纖維化的關鍵調節因子在促進SSc炎癥和纖維化2個主要特征方面具有直接和雙重作用，阻斷Sema4A信號可抑制SSc的這2種病理過程，提示Sema4A可能是SSc新的治療靶點。

3.1.5 類風濕關節炎 類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性侵蝕性關節病變為主要表現的全身性自身免疫性疾病。研究發現，RA患者滑膜液和組織中Sema4A水平較骨性關節炎（osteoarthritis，OA）患者升高，且滑膜液中Sema4A水平與RA疾病活動評分呈正相關［27］。體外采用重組Sema4A蛋白處理可通過促進RA滑膜成纖維樣細胞（RASFs）產生IL-6加重炎癥反應。機制研究表明，Sema4A通過PlexinB1激活NF-κB信號，Sema4A/NF-κB通過調節IL-6促進炎癥反應參與RA發病過程［27］。提示Sema4A表達增加可促進RA炎癥發生和疾病進展，Sema4A可能是NF-κB信號的直接靶點，阻斷Sema4A/NF-κB信號可能是RA治療的新手段。

3.2 Sema4A與腫瘤 血管新生是腫瘤發生、發展的重要過程，研究發現，Sema4A與內皮細胞上的PlexinD1受體結合可抑制VEGF誘導的血管新生，從而發揮抗腫瘤作用［9］。但也有研究表明，Sema4A可通過VEGF-A/VEGF-2信號促進血管新生［17］。目前關于Sema4A在腫瘤中的研究較少，究竟是“促進腫瘤”還是“抑制腫瘤”作用尚未明確［28］。最近研究發現，乳腺癌患者血清及組織中Sema4A表達增加，低氧環境下沉默Sema4A表達可抑制乳腺癌細胞增殖、VEGF產生、MAPK/ERK1/2及Akt、STAT3磷酸化，并誘導乳腺癌細胞凋亡［29］。KINNERSLEY等［30］研究發現，家族性結直腸癌患者更易出現Sema4A突變，且Sema4A突變顯著促進MAPK/ERK和PI3K/Akt信號活化。PAN等［31］研究發現，敲低肝癌細胞系中的Sema4A可減緩上皮-間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進程，敲除Sema4A可逆轉EMT并提高肝癌細胞對阿霉素的敏感性，提示Sema4A可能通過誘導EMT導致肝癌細胞對阿霉素的耐藥性。此外，研究發現，Sema4A-PlexinB1可發揮雙向作用，Sema4A作為受體與PlexinB1配體結合，促進Sema4A與其下游效應因子極性蛋白Scrib相互作用，調控腫瘤細胞遷移和侵襲及DCs的趨化性［32］。表明Sema4A參與腫瘤發生發展，但其在腫瘤中的作用尚未明確，進一步研究Sema4A在腫瘤發生與轉移過程中的作用有望為腫瘤免疫治療提供新思路。

3.3 Sema4A與其他疾病

3.3.1 過敏性哮喘 過敏性哮喘是由多種細胞尤其是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥，Th2型細胞因子及血清IgE水平升高在哮喘發病過程中扮演重要作用［33］。卵清蛋白（OVA）誘導的Sema4A-/-小鼠與野生型小鼠氣道變應性炎癥實驗動物模型研究發現，Sema4A-/-小鼠氣道嗜酸性細胞浸潤增加并伴有支氣管上皮細胞增生，與支氣管肺泡灌洗液中IL-13含量增加，CD4+、CD8+T細胞數增加及Tregs數降低有關［33］。重組Sema4A蛋白可明顯下調急性和慢性過敏性哮喘小鼠的過敏性炎癥反應，而采用抗Tim-2單克隆抗體處理后過敏性炎癥反應加重，提示Sema4A與Tim-2相互作用可能對過敏性喘炎癥反應調節起關鍵作用，表明Sema4A缺陷參與過敏性哮喘發生發展［12］；Sema4A是Th2細胞驅動的肺部病理生理過程重要調節因子，可下調過敏反應［12］。但最新研究發現，人類與小鼠不同，Sema4A在過敏性哮喘患者肺組織呈高表達，通過與CD4+T細胞上的ILT-4受體結合促進Th2細胞分化［4］。表明Sema4A參與過敏性哮喘的發生發展，有望成為過敏性哮喘的治療靶點；但人Sema4A與小鼠Sema4A在過敏性哮喘發病過程中的作用可能不同，仍需進一步研究。

3.3.2 OA Sema4A在炎癥發生過程中發揮關鍵調節作用［34］。炎癥是OA發病的基礎，最新研究表明，Sema4A在OA患者膝關節軟骨及體外經IL-1β處理的軟骨細胞中表達上調，且Sema4A通過促進Rac1/Akt依賴性IκBα磷酸化激活NF-κB信號，同時NFκB活化有助于Sema4A增強IL-14對軟骨細胞的分解代謝作用［35］。表明Sema4A是軟骨細胞中NF-κB細胞依賴性分解代謝的新型調節因子，可能在OA發病機制中發揮重要作用。

3.3.3 視網膜退行性疾病 Sema4A在光感受器的存活中起重要作用，人Sema4A基因突變被認為是導致視網膜退行性疾病的原因之一［5］。目前在視網膜退行性疾病患者中已鑒定出3個Sema4A錯義突變基因：D345H、F350C及R713Q［36］。但將這些突變基因敲入小鼠體內，僅有F350C突變可導致嚴重的視網膜退行性病變，采用慢病毒介導的Sema4A基因轉染治療可成功阻止Sema4AF350C/F350C和Sema4A-/-小鼠的光感受器退化［37］。表明人和小鼠的Sema4A序列差異可能是基因突變影響不同的原因。最新研究報道，3個視網膜變性家族的發病和未發病個體中均觀察到R713Q突變，提示R713Q突變可能是良性多態性失明的危險因素，當與另一個基因突變同時存在時可能致病，單獨存在不足以致病［38］。目前關于Sema4A基因突變在視網膜退行性疾病中的作用研究較少且結論不一致，但對于已明確的致病性Sema4A基因突變，基因治療可作為視網膜退行性疾病的一種非常有前景的治療手段。

4 結語

綜上所述，Sema4A通過與不同受體結合發揮不同的生物學作用，并調節T細胞、DCs及巨噬細胞等免疫細胞功能，在自身免疫性疾病、過敏性疾病、炎癥和腫瘤發生發展中發揮重要作用。但目前關于Sema4A的免疫調節功能及其在疾病中作用的研究結果尚未統一，且調控Sema4A作用的信號通路尚未闡明。因此，進一步研究Sema4A的免疫調節功能及其在疾病中的作用，闡明調控Sema4A作用的信號通路有望為以Sema4A為靶點的免疫治療提供新思路。