CXXC 鋅指蛋白1 在惡性腫瘤中的研究進展

王東升穆思宇王健崗謝龍飛鐘翔宇

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院膽胰外科,哈爾濱 150086)

近年來通過高通量測序技術對惡性腫瘤的表觀基因組進行了大規模的系統研究,發現有不同程度的轉錄控制失調,主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA 的異常表達等,與惡性腫瘤的發生發展密切相關[1]。隨著表觀遺傳學的迅猛發展,一些未知的表觀調節子相繼被發現。1999 年,研究者通過雙鏈寡核苷酸探針成功分離出一種新型編碼人類 CpG 結合蛋白-CXXC 鋅指蛋白 1(CXXC finger protein-1, CFP1)的cDNA,CFP1 基因位于人染色體18q21.1 區域,全長2487 bp,轉錄生成的蛋白由656 個氨基酸序列組成,定位于細胞核中[2]。在哺乳動物細胞內CFP1 蛋白只能與未甲基化的核苷酸序列結合,通過調控 DNA 甲基轉移酶 1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化[3]。CFP1 也是組蛋白甲基轉移酶Set1 的亞基,于H3 組蛋白4 號賴氨酸上進行三甲基化(H3K4me3),使染色質處于開放狀態促進基因表達[4]。CFP1 在DNA 甲基化和組蛋白修飾中發揮重要作用,可能和惡性腫瘤的發生發展密切相關。研究發現CFP1 發生基因突變、異常表達和與DNMT1 結合障礙等對惡性腫瘤的發生發展有促進或抑制作用。本文簡要綜述CFP1 的基本功能及在惡性腫瘤中的研究進展,以期為后續研究新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點提供依據。

1 CXXC1 的基本功能

1.1 CFP1 與 DNA 甲基化

DNA 甲基化是在 DNA 甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)催化作用下在基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5 號碳原子上共價結合一個甲基基團,能引起 DNA 構象、DNA 穩定性及 DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而調控基因表達[5]。DNA 甲 基 轉 移 酶 主 要 包 括 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b,DNMT3a 和 DNMT3b 完成 DNA初始甲基化,DNMT1 維持DNA 的甲基化狀態[6]。此外,研究發現DNMT1 在DNA 初始甲基化中同樣發揮重要作用[7]。在許多哺乳動物細胞基因組中存在大量散在的甲基化的CpG 二核苷酸,而在某些區域,如基因的啟動子處存在高度聚集的CpG 二核苷酸,它們被稱為CpG 島(CpG islands, CGIs),大約72%的人類基因啟動子位于CGIs,它們的甲基化水平很低[8]?；騿幼訁^域CGIs 的甲基化與基因沉默密切相關,甲基化的DNA 可以招募甲基結合蛋白(methyl-binding domain proteins, MBDs)抑制轉錄因子的結合。而在腫瘤細胞中CGIs 往往呈高甲基化狀態,這種高甲基化狀態是導致抑癌基因失活的一個重要機制[9]。

CFP1 通過調控DNA 甲基轉移酶1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化,Butler 等[10]研究發現缺乏CFP1 的小鼠胚胎干細胞(ES)整體基因組70%的胞嘧啶甲基化下降,并伴隨著多聚核糖體水平降低, 導致翻譯起始降低。盡管DNMT1 轉錄水平顯著升高,但DNMT1蛋白合成減少。通過脈沖/chase 分析結果顯示在CFP1 缺失的小鼠胚胎干細胞(ES)中DNMT1 蛋白半衰期也有一定程度的降低?；谝陨辖Y果,Tate等[11]進一步研究發現缺乏CFP1 的胚胎干細胞參與DNA 堿基切除修復的核酸內切酶(Apyrimidinic endonuclease/Redox factor-1, Ape1/Ref-1)蛋白表達下降,DNA 損傷增加。這些結果揭示了Cfp1 在翻譯起始及DNA 損傷修復中的作用,表明CFP1 缺失會導致基因組胞嘧啶甲基化水平下降、DNMT1 蛋白合成和半衰期降低及DNA 損傷增加。

1.2 CFP1 與組蛋白修飾

組蛋白與DNA 共同組成核小體,是染色質的基本結構單位,組蛋白氨基末端(N 端)結構域伸出核小體同其他調節蛋白和DNA 發生相互作用。其N端尾區可進行乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、蘇素化、ADP 核糖基化等修飾,可改變染色質的狀態及調控基因的表達,進而引起腫瘤的發生發展[12]。

組蛋白甲基化修飾相關蛋白主要包含組蛋白甲基轉移酶(HMTs) 和組蛋白去甲基轉移酶(HDMTs)。組蛋白甲基化對基因表達的影響較為復雜,主要取決于被修飾的氨基酸位點,而甲基化程度又分為三個水平,分別為一甲基化、二甲基化、和三甲基化(me1/me2/me3)即分別在同一個氨基酸位點添加一個甲基、兩個甲基和三個甲基[13]。某些被沉默的抑癌基因啟動子區域均可發現H3K4me2/3 修飾的缺失以及 H3K9me2/3、H3K27me3 修飾的獲得[14]。大多數組蛋白甲基轉移酶都通過Set 結構域來發揮主要功能,CFP1 作為組蛋白H3K4 甲基轉移酶Set1 的組成單位與未甲基化的CpG 島結合定位H3K4me3 到染色質上,從而調控染色質的結構,促進基因表達[3]。

Yu 等[15]研究發現在卵母細胞中CFP1 修飾的H3K4me3 與基因啟動子相關,并在發育過程中使啟動子激活并轉錄。Sha 等[16]研究發現在成熟卵母細胞中CFP1 是H3K4me3 積累和沉積在染色質上所必要的蛋白,缺乏CFP1 將導致H3K4me3 降低,進一步導致轉錄活性下降、卵母細胞減數分裂障礙、受精后無法完全成熟。基于以上結果,Sha等[17]進一步研究發現卵母細胞缺失CFP1,直接破壞了基因表達模式,間接破壞了促黃體激素的作用和損害了促卵泡激素對顆粒細胞的基本信號通路,導致卵泡生長和排卵均受到影響。以上研究表明CFP1 對H3K4me3 的修飾對卵母細胞增值、減數分裂、基因表達、信號轉導至關重要。

2 CXXC1 在惡性腫瘤中的研究

2.1 CFP1 與胃癌

胃癌是一個全球性的健康問題,是癌癥相關死亡的第三大主要原因,越來越多的研究表明胃癌的表觀遺傳異?？梢源龠M癌變發生[18]。Sun 等[19]對84 例胃癌患者進行了研究,通過免疫組化方法檢測胃癌組織中CFP1 與14-3-3 蛋白表達水平,并進行相關性分析。14-3-3 蛋白在哺乳動物中存在7 個亞型(α/β,γ,ε,ζ,η,σ 和 θ/τ),由不同的基因編碼,可參與細胞內信號轉導、細胞周期調控和細胞遷移、分化、凋亡等過程[20]。14-3-3σ 編碼基因的甲基化會導致14-3-3σ 蛋白在腫瘤細胞中持續低表達,會對P53 產生負性調控作用,從而促進腫瘤細胞的增值[21]。研究發現,在同一視野中CFP1 的表達量與14-3-3 蛋白的表達呈負相關,CFP1 呈高表達的患者總體生存時間小于呈低表達的患者,而14-3-3 蛋白對患者生存時間的影響則與CFP1 相反。Mai 等[22]研究發現 CFP1 與 14-3-3 蛋白之間的相互作用與核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白有關,在B 細胞中14-3-3 蛋白的表達依賴于 NF-κB 蛋白在 14-3-3 基因啟動子區募集CFP1 蛋白,CFP1 是組蛋白甲基轉移酶Set1 的指南針,使啟動子特異性地富集了H3K4me3,使染色質處于開放狀態,標志轉錄激活。因此可以推測CFP1與14-3-3 蛋白通過NF-κB 蛋白可能會影響胃癌細胞的細胞周期、細胞遷移及侵襲能力等,但仍需進一步實驗證明。CFP1 可能會成為胃癌患者新的分子標志物及潛在的治療靶點。

2.2 CFP1 與結直腸癌

結直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一,由于正常結腸上皮細胞一系列遺傳和表觀遺傳改變的逐步積累,導致結直腸腺瘤和侵襲性腺癌的發生[23]。

相關研究報道,在60%～70%的大腸癌細胞中18q 染色體缺失,表明該區域可能含有與大腸癌發生有關的抑癌基因(TSGs)[24]。盡管18q 染色體缺失常影響染色體臂的大部分,但結腸癌基因(DCC)缺失的18q21 染色體最小區域已被確定,在同一4mb 染色體區域內還存在甲基 CpG 結合蛋白1(MBD1)、甲基 CpG 結合蛋白 2(MBD2)、CpG 結合蛋白(CFP1)、sma 和 mad 相關蛋白 4(SMAD4)。為了探究該區域是否存在抑癌基因,Derks 等[25]發現在結腸癌細胞中只有DCC基因啟動子被高甲基化,導致表達沉默,而其它臨近基因MBD1、MBD2、CFP1、SMAD4 不受影響。此外,Bader 等[26]研究表明CFP1 在結直腸癌細胞中突變率很低,常被認為是與結腸癌發生無關的突變。綜上研究表明CFP1基因可能不是結直腸癌中潛在的抑癌基因,CFP1基因突變在結直腸癌中的作用有限。

2.3 CFP1 與肺癌

在全球范圍內,肺癌是最常見的惡性腫瘤,據報道表觀遺傳改變在肺癌的發生發展中起重要作用,DNA 甲基化、組蛋白修飾和RNA 表達在肺癌的早期發現、評估預后和治療中具有重要意義[27]。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs, lnc RNA)與多種癌癥的發生發展相關[28]。Tao 等[29]研究發現在肺癌中 lnc RNA P53RRA 表達下調,P53RRA 可以與RNA 結合蛋白(G3BP)結合,取代G3BP 復合物中的P53,導致P53 更多的保留在細胞核中,進而促進細胞凋亡,抑制腫瘤進展,發揮抑癌作用。Mao 等[30]通過對比肺癌細胞和正常細胞發現,CFP1 在癌細胞中與未甲基化的CpG 島結合力降低,導致癌細胞 P53RRA 蛋白轉錄起始位點H3K4me3 降低、H3K27me3 顯著升高,抑制 P53RRA蛋白表達。在肺癌細胞中誘導CFP1 過表達會增加P53RRA 的表達水平,發揮抑癌作用。

有研究表明肺泡巨噬細胞在肺癌早期起識別并清除腫瘤細胞的作用,隨著腫瘤發展又在腫瘤細胞的生長、轉移、侵襲過程中發揮重要作用[31]。Hui等[32]研究發現CFP1 缺失會導致粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的受體亞基Csf2rα 基因啟動子區H3K4 的修飾減少,導致肺泡巨噬細胞的吞噬和殺菌活性降低。小鼠缺乏CFP1 容易受到細菌感染,在小鼠肺組織表現出自發的炎癥癥狀,包括炎癥細胞的侵潤和表面活性磷脂蛋白的積累?；謴虲sf2rα 的表達可以逆轉肺泡巨噬細胞活性。肺癌發生發展過程中存在復雜的調節機制,適度的刺激CFP1 蛋白的表達可能是治療肺癌的潛在靶點,但尚需進一步研究證實。

2.4 CFP1 與膠質瘤

膠質瘤是最常見的原發性惡性腦瘤,以治療耐藥而聞名。在過去的十年中,表觀調控基因的突變被認為是膠質瘤發生的關鍵驅動因素。在成人膠質母細胞瘤患者中,啟動子甲基化導致的DNA 修復基因MGMT表觀遺傳沉默可以預測烷基化劑治療的療效。這些表觀遺傳改變被用作生物標記,并在膠質瘤的分類和治療決定中發揮核心作用[33]。

Bronner 等[34]研究發現 CFP1 對 DNA 甲基化修飾是通過與DNMT1 相互作用實現的,抑制CFP1 表達后 DNMT1 活性明顯降低,而 DNMT3a、DNMT3b活性無明顯變化。DNA 甲基化是基因組的一個生物學過程,DNMT 水平升高而引起啟動子和其他調控區域的局部高甲基化,從而使腫瘤抑制基因沉默,因此有研究者提出DNMT 抑制劑是表觀遺傳藥物開發的潛在靶點,可能為膠質瘤治療耐藥患者提供新的治療方案[35]。

有研究表明DNMT1 可能與癌基因或抑癌基因的沉默有關,DNMT 抑制劑的最初目的是促進被DNA 高甲基化的抑癌基因重新激活,而不促進其它癌基因的激活,因此理想的DNMT 抑制劑需要靶向特定的 DNMT 復合物[36]。Cheray 等[37]實驗表明DNMT1/USP7、DNMT1/Cfp1、DNMT1/Stat3 復合物在腦、乳腺和肺腫瘤中表達明顯增加。通過將U251細胞皮下注射到小鼠體內,然后使用替莫唑胺(TMZ)和針對三種復合物的抑制劑治療,結果表明,TMZ 和DNMT1/CFP1 抑制劑治療組,TMZ 抗膠質瘤細胞的死亡百分比明顯增加,腫瘤生長效率明顯降低。異種移植建立體內膠質瘤模型實驗表明特異性抑制DNMT1/CFP1 復合物同樣增加了膠質瘤細胞死亡的百分比,具有提高抗腫瘤療效的作用。說明抑制CFP1 與DNMT1 的相互作用可提高化療藥物TMZ 的效果,但具體機制還有待于研究。

2.5 CFP1 與 MLL 白血病

混合譜系白血病(mixed lineage leukemia.MLL)是一類惡性程度高、預后差的難治性急性白血病,因此急需開發特定的靶向治療。MLL基因由急性白血病的染色體異位產生,編碼產生白血病的MLL融合蛋白。研究發現Hoxa9 基因的表達對急性白血病的發生有促進作用,而MLL 融合蛋白的結構域中含有與DNA 結合的CXXC 結構域,能夠與未甲基化的DNA 結合,使Hoxa9 基因位點的CpG 殘基和組蛋白 H3K9 不發生甲基化,促進Hoxa9 基因的表達[38-39]。

Risner 等[40]尋找是否存在類似的MLL CXXC結構域,進行替換,以期尋找新的治療靶點,研究者選擇了 DNMT1、MBD1、CFP1 三種蛋白中的 CXXC結構域,用以替換MLL 融合蛋白的CXXC 結構域。首先比較與未甲基化DNA 結合的親和力,結果:MLL CXXC 結構域與未甲基化的DNA 親和力最強,CFP1 CXXC 結構域與未甲基化的DNA 親和力比MLL CXXC 結構域低 7 倍。DNMT1 CXXC 結構域比 MLL CXXC 結構域低 34.4 倍,而 MBD1 CXXC 結構域與未甲基化的DNA 無親和力。在骨髓集落復制實驗和體內白血病實驗表明只有DNMT1CXXC結構域能夠功能性替代 MLL CXXC 結構域,使Hoxa9 基因位點的CpG 殘基和組蛋白H3K9 不發生甲基化。雖然初步研究表明MLL 白血病中CFP1 CXXC 結構域不能功能性代替MLL CXXC 結構域,但是能否通過CFP1 調控DNMT1 用于治療白血病仍值得進一步探索。

Young 等[41]研究發現,人類 PLB-985 細胞(人急性髓系白血病細胞)的正常增值分化需要CFP1蛋白。敲除CFP1 基因導致細胞存活率降低約50%,倍增時間延長,并且不能向單核細胞及粒細胞分化。由此可見CFP1 蛋白是PLB-985 細胞生存、增殖、分化的必要蛋白,能否通過調控CFP1 基因的表達來治療白血病值得進一步研究探索。

3 小結及展望

綜上研究表明,CFP1 主要調控 DNMT1 和H3K4me3 以外,還存在其它調節通路,參與表觀遺傳修飾,與多種惡性腫瘤的發生、治療及不良預后密切相關,但其復雜的調節機制研究以及大樣本隊列研究加速其在臨床中的應用仍處于初級階段,亟待進一步的探索研究。隨著表觀遺傳學的發展,CFP1 在臨床方面的研究會越來越深入,期望CFP1在惡性腫瘤診斷、治療及預后中成為新的突破點。