重組人促紅細(xì)胞生成素對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎性因子及線粒體損傷的影響

詹亞琨羅 艷鄒 蓓

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科, 南昌 330006; 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像中心,南昌 330006;3.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,南昌 330006)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI) 是臨床上最常見的神經(jīng)外科疾病之一[1]。臨床上主要表現(xiàn)為眩暈、頭痛或者意識障礙,進(jìn)而導(dǎo)致各種神經(jīng)功能障礙、運動障礙甚至喪失生活自理能力[2]。目前造成TBI 的主要因素是交通事故和暴力事件。因其后期的高致死率、高致殘率,給患者的家庭以及社會都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此尋找可靠的治療手段,恢復(fù)患者的神經(jīng)功能,提高患者的生存率,已成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究重點。研究表明[3]創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織的炎癥反應(yīng)是后期病程發(fā)展中最重要的病理改變。Hinson 等[4]研究指出TBI 后神經(jīng)細(xì)胞的線粒體功能障礙參與了腦損傷后的病理演變的全過程。因此從目前神經(jīng)外科醫(yī)治手段出發(fā),尋找藥物控制炎性反應(yīng)以及降低或者緩解神經(jīng)細(xì)胞的線粒體障礙已成為控制創(chuàng)傷性腦損傷病程發(fā)展的有效途徑[5]。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)是臨床上治療由腎功能不全引起的貧血的常用藥物。藥理學(xué)研究表明[6]rhEPO 具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的作用。近年來研究證明[7]rhEPO 在TBI 中具有腦組織保護(hù)的作用,對中風(fēng)、腦出血、以及創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療作用。周龍等[8]研究證明rhEPO 能夠減輕TBI 小鼠的腦損傷,抑制炎癥反應(yīng),改善T 細(xì)胞平衡。因此本研究通過建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型,從rhEPO 對線粒體以及炎性反應(yīng)的角度來探討rhEPO 對創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機制,為日后的臨床研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36 ～40 月齡,SPF 級,280 ～ 320 g,雄性 SD 大鼠共計60 只,提供自我院實驗動物實驗中心[SCXK(贛)2018-0009],依照我院實驗動物管理辦法,所有大鼠在本院動物房中[SYXK(贛)2018-0003],室溫 18℃ ～25℃,濕度在(56±5)%內(nèi),適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗;本研究中涉及動物的實驗操作中給與動物人道的關(guān)懷按3R 原則進(jìn)行,并經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC-2019-093)。

1.2 主要試劑與儀器

重組人促紅細(xì)胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rhEPO)采購自北京四環(huán)生物制藥有限公司;Rh123 染色劑采購自Sigma 公司;動力相關(guān)蛋白1(Drp-1)、分裂蛋白 1(Fis-1)、融合蛋白 2(Mfn 2)、視神經(jīng)萎縮蛋白1 (Opa 1)抗體采購自美國Abcam 公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)化學(xué)發(fā)光試劑盒采購自南京建成生物技術(shù)有限公司;IL-1β、IL-6 和 TNF-α 抗體采購自美國 (Cell Signaling Technology,CST)公司;實驗用動物麻醉劑5%戊巴比妥鈉(德國進(jìn)口分裝,每瓶250 g)采購自北京化學(xué)試劑公司;冰凍切片包埋劑采購自美國櫻花公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 創(chuàng)作性腦損傷大鼠模型的制備以及實驗分組處理

將已進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)的大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham 組)模型組、rhEPO 干預(yù)組(治療組),每組20 只,其中模型組、治療組采用改良過的Feeney 自由落體撞擊大鼠頭部來建立創(chuàng)傷性大鼠模型:將戊巴比妥鈉(5%,0.15 mL/100 g)腹腔注射以麻醉大鼠,將大鼠以俯臥位固定,沿顱骨正中線行縱切口,暴露右側(cè)頂骨,在矢狀縫旁開2 mm 處,以顱骨鉆造一個直徑5 mm 的孔。使用致傷力度為20 g 的小錘從50 cm 的高度自由落下,以制成大鼠右側(cè)大腦腦挫裂傷,保持大鼠硬腦膜完整,止血結(jié)束后無菌手術(shù)針縫合;本實驗中動物實驗處理手段符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。sham 組大鼠除不撞擊操作外,其余同上。術(shù)后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的肢體抽搐,四肢平衡協(xié)調(diào)性變差,呼吸不規(guī)則,瞳孔擴大或縮小,瞳孔對光反應(yīng)減弱,睫毛反射、刺痛反應(yīng)以及角膜反射消失,部分出現(xiàn)口腔或鼻腔出血現(xiàn)象甚至?xí)簳r性昏迷,但經(jīng)行為學(xué)觀察各行為異常在30 min 內(nèi)恢復(fù)認(rèn)定造模手術(shù)成功。在造模結(jié)束后,治療組每日定時以5000 IU/kg 劑量rhEPO 進(jìn)行腹腔注射,sham組和模型組腹腔注射等劑量生理鹽水,連續(xù)給藥7 d后處死大鼠,并且斷頭取腦,將各組大鼠的全腦組織在5%多聚甲醛中進(jìn)行室溫固定,48 h 后,以大鼠挫傷灶為中心,以2 cm 為半徑,切取2 mm 厚的標(biāo)本,常規(guī)脫水后,以液氮封存,置于深冷冰箱中待測。實驗過程中 sham 組死亡2 只,模型組死亡3只,治療組死亡1 只,最終每組均納入15 只大鼠進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.2 HE 染色觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)變化

從深冷冰箱中取出各種大鼠的腦組織標(biāo)本,在分析天平上分別稱取100 mg,制成5 μm 厚度大小的切片,HE 染色,US-2018 熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦組織損傷情況。

1.3.3 各組大鼠腦組織線粒體膜電位的檢測

取各組大鼠的腦組織樣品,在分析天平上分別稱取100 mg,常規(guī)方法固定,常規(guī)裂解后,制成單細(xì)胞懸液,按Rh123 試劑盒要求進(jìn)行染色,清洗,US-2018 熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh123 的線粒體。對圖像中的綠色熒光強度使用圖像軟件Image J 1.41 進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.4 透射電鏡觀察各組大鼠腦組織細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

從深冷冰箱中取出各種大鼠的腦組織標(biāo)本,在分析天平上分別稱取100 mg,將大鼠腦組織制成超薄組織切片:①用30%聚甲醛和0.05%鋨酸將其固定1 h。②無菌脫水5 min。③置于預(yù)冷4℃乙醇3 min。④環(huán)氧樹脂 812 浸透 5 min,石蠟包埋。⑤鈾鉛進(jìn)行雙重染色,制成50 nm 的超薄切片,上透射電鏡觀察,應(yīng)用Simple-PCI8.0 圖像軟件進(jìn)行分析,獲取大鼠腦組織細(xì)胞的線粒體比表面積、體密度、數(shù)密度、以及比膜面積等參數(shù)。

1.3.5 免疫組化檢測組各組標(biāo)本中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)

從深冷冰箱中取出各種大鼠的腦組織標(biāo)本,在分析天平上分別稱取100 mg,根據(jù)免疫組化試劑盒要求進(jìn)行固定,包埋,切片,抗原修復(fù),封閉,清洗,滴入一抗,孵育,加入二抗,顯色,復(fù)染,脫水,封片,顯微鏡下觀察。用MetaMorPH 圖像軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的陽性細(xì)胞比例。

1.3.6 蛋白免疫印跡檢測 Drp-1、Fis-1、Mfn 2、Opa 1 的表達(dá)水平

從深冷冰箱中取出各種大鼠的腦組織標(biāo)本,在分析天平上分別稱取100 mg,常規(guī)提取總蛋白及測定其濃度,取50 μg 蛋白上樣,經(jīng)凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別加稀釋好的一抗(1 ∶1000),4℃過夜孵育。次日,加適量二抗(1 ∶5000), 洗膜,顯色,拍照及灰度掃描,以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白,Image J 軟件分析條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用軟件SPSS 19.0 進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行來表示符合正態(tài)分布的計量資料,采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,采用獨立t檢驗進(jìn)行兩兩組間比較,當(dāng)P<0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色

HE 觀察各組大鼠腦組織病理變化如圖1 所示,sham 組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列規(guī)則,無腫脹,無出血等現(xiàn)象,未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠腦組織腦水腫嚴(yán)重,可見明顯的出血壞死病灶,病灶區(qū)可見大量變性環(huán)死的神經(jīng)細(xì)胞,病灶周圍可見大量的炎性細(xì)胞浸潤,并且細(xì)胞核固縮明顯,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞基質(zhì)疏松。治療組大鼠腦組織腦水腫明顯減輕,病灶區(qū)及水腫區(qū)明顯變小,壞死細(xì)胞減少,炎性細(xì)胞浸潤較少。

2.2 各組大鼠腦組織線粒體膜電位的檢測

本研究采用羅丹明123(rhodamine 123,Rh123)熒光染色來檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的變化,進(jìn)而能夠反映細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。Rh123 染色結(jié)果如圖2 所示,與sham 組相比,模型組大鼠腦組織細(xì)胞Rh123熒光強度明顯減弱(P<0.05),線粒體膜損傷嚴(yán)重;與模型組相比,治療組腦組織中細(xì)胞Rh123 熒光強度明顯增強(P<0.05),說明治療組大鼠腦組織中線粒體損傷有所恢復(fù)。

2.3 各組大鼠腦組織中與線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白的表達(dá)

腦組織細(xì)胞基質(zhì)中的線粒體處于動態(tài)相對平衡的細(xì)胞器,主要通過線粒體內(nèi)外膜的裂解和融合而改變其形狀,使其在長的相互連接的網(wǎng)絡(luò)狀性態(tài)和不連接的破碎的性態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換,細(xì)胞生物學(xué)上將這中動態(tài)平衡過程稱為細(xì)胞線粒體的動力學(xué)[9-10]。動力相關(guān)蛋白1(Drp-1)和分裂蛋白1(Fis-1)是調(diào)節(jié)線粒體膜裂解的主要蛋白,Drp-1 通過接頭蛋白Fis-1 相互作用定位在線粒體膜上,進(jìn)而促進(jìn)線粒體裂解; 調(diào)節(jié)線粒體外膜相融合的蛋白是融合蛋白2(Mfn 2),調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜相融合的是為視神經(jīng)萎縮蛋白1(Opa 1)。

本研究中采用研究采用Western blot 法檢測各組大鼠腦組織中 Drp-1、Fis-1、Mfn 2、Opa 1 蛋白的表達(dá)水平以進(jìn)一步提示rhEPO 對腦組織線粒體的作用機制,,結(jié)果顯示,和sham 組相比,模型組大鼠腦組織中Drp-1、Fis-1 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),Mfn 2、Opa 1 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05);和模型組組相比,治療組大鼠腦組織中Drp-1、Fis-1 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05),Mfn 2、Opa 1 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),見圖3。

2.4 透射電鏡觀察各組大鼠腦組織細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

為更加直觀的了解各組大鼠腦組織中線粒體的變化,本研究中采用電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖4 所示,sham 組大鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞膜完整,線粒體形態(tài)正常,嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨,并且排列整齊,細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等內(nèi)容物結(jié)構(gòu)完整,清晰可辨,無腫脹、溶解等現(xiàn)象。模型組大鼠腦組織中細(xì)胞內(nèi)容物或腫脹或結(jié)構(gòu)重疊或者破裂,線粒體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象,多數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變,嵴結(jié)構(gòu)變形或者變少或者缺失,部分線粒體嵴病變成為空泡樣嵴,線粒體基膜模糊,整個神經(jīng)元內(nèi)線粒體總數(shù)量明顯減少。治療組大鼠腦組織內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn),線粒體空泡樣變性明顯緩解,稍見腫脹,線粒體的數(shù)量明顯增多,結(jié)構(gòu)趨于正常,僅有部分線粒體輕度腫脹,線粒體嵴結(jié)構(gòu)的數(shù)目和形態(tài)也趨于正常,偶見線粒體嵴斷裂或消失。

注:A:sham 組;B:模型組;C:治療組。白色箭頭所指為神經(jīng)元細(xì)胞。圖1 HE 染色結(jié)果Note.A, sham group.B, model group.C, treatment group.The white arrows refer to neuronal cells.Figure 1 The result of HE staining

注:A:sham 組;B:模型組;C:治療組。與 sham 組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。下同。圖2 Rh123 染色結(jié)果Note.A, sham group.B, model group.C, treatment group.Compared with rats in the sham group, ?P <0.05.Compared with rats in the model group, #P <0.05.The same as below.Figure 2 The result of Rh123 staining

各組大鼠腦組織線粒體體視學(xué)分析如圖5 所示,與sham 組相比,模型組腦組織中線粒體的體密度數(shù)值、比表面積、比膜面積以及數(shù)密度數(shù)值均明顯減小(P<0.05),說明模型組的線粒體損傷嚴(yán)重;與模型組相比,治療組線粒體的體密度數(shù)值、比表面積、比膜面積以及數(shù)密度數(shù)值均明顯增大(P<0.05),說明治療組的線粒體損傷有所恢復(fù)。

2.5 各組大鼠腦組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)

各組大鼠腦組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)如圖6～8 所示,與sham 組相比,模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6 和 TNF-α 陽性細(xì)胞比例出現(xiàn)了明顯升高(P<0.05),與模型組相比,治療組腦組織中細(xì)胞 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 陽性細(xì)胞比例出現(xiàn)了明顯降低(P<0.05)。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是嚴(yán)重危害人類健康的急性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因TBI 所引發(fā)的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重影響了TBI 的根治性治愈[11]。研究表明[12]炎性反應(yīng),線粒體損傷以及興奮性氨基酸神經(jīng)毒性作用使導(dǎo)致TBI 后腦神經(jīng)功能受損的重要原因。因此尋找一種能有效控制炎性反應(yīng)或者緩解線粒體功能障礙的的藥物或者治療手段是改善TBI 患者治療及預(yù)后的的關(guān)鍵所在。

圖3 Western blot 檢測結(jié)果Figure 3 Result of Western blot

圖4 電鏡觀察結(jié)果Figure 4 Result of electron microscope

圖5 各組大鼠腦組織線粒體體視學(xué)分析Figure 5 Stereoscopic analysis of mitochondrial in brain tissue of rats in each group

重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)是體內(nèi)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白。大量的動物模型實驗證明[13]rhEPO 在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮了抗氧化、抗炎癥、減輕腦水腫、抗興奮性毒性,以及促血管新生、血腦屏障保護(hù)的作用。隨著臨床研究的進(jìn)展,rhEPO 在創(chuàng)傷性腦損傷和缺血性腦卒中發(fā)揮的的神經(jīng)保護(hù)引起關(guān)注。段淼等[14]研究報道rhEPO 能夠改善腦損傷后新生大鼠的認(rèn)知功能。楊利輝等[15]連續(xù)3 周給與急性缺血性腦卒中患者皮下注射rhEPO,發(fā)現(xiàn)rhEPO 能減少急性缺血性腦血管病患者的梗死面積,改善其臨床療效。已有臨床研究證實[16]rhEPO能夠抑制炎性反應(yīng),抑制急性腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和具有促進(jìn)血管生成的作用。但是有關(guān)rhEPO 在TBI 后腦損傷的線粒體功能障礙中的作用少見報道。

本研究中采用改良過的Feeney 自由落體撞擊大鼠頭部來建立創(chuàng)傷性大鼠模型[17],造模操作過程簡便易行,造模結(jié)束后HE 觀察模型組大鼠腦組織腦水腫嚴(yán)重,可見明顯的出血壞死病灶,病灶區(qū)可見大量變性環(huán)死的神經(jīng)細(xì)胞,病灶周圍可見大量的炎性細(xì)胞浸潤,并且細(xì)胞核固縮明顯,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞基質(zhì)疏松,TBI 癥狀明顯。采用rhEPO 治療后,治療組大鼠腦組織腦水腫明顯減輕,病灶區(qū)及水腫區(qū)明顯變小,壞死細(xì)胞減少,炎性細(xì)胞浸潤較少,TBI 癥狀明顯減輕。

圖6 免疫組化檢測IL-1β 的表達(dá)Figure 6 Immunohistochemical detection of the expression of IL-1β

圖7 免疫組化檢測IL-6 的表達(dá)Figure 7 Immunohistochemical detection of the expression of IL-6

圖8 免疫組化檢測TNF-α 的表達(dá)Figure 8 Immunohistochemical detection of the expression of TNF-α

線粒體是細(xì)胞的“power house”,是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的主要場所。因此線粒體結(jié)構(gòu)的損傷是最能體現(xiàn)細(xì)胞病變或者損傷的指標(biāo)[18]。本研究中采用Rh123 染色、Wetern blot 法來研究各組大鼠腦組織中線粒體膜電位的變化以及與線粒體動力學(xué)相關(guān)的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明:與sham 組相比,模型組大鼠腦組織細(xì)胞Rh123 熒光強度明顯減弱(P<0.05),腦組織中Drp-1、Fis-1 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),Mfn 2、Opa 1 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05),說明模型組大鼠腦組織中線粒體膜結(jié)構(gòu)的損傷嚴(yán)重。與模型組相比,治療組腦組織中細(xì)胞Rh123 熒光強度明顯增強(P<0.05),腦組織中Drp-1、Fis-1 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05),Mfn 2、Opa 1 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),說明治療組大鼠腦組織中線粒體損傷有所恢復(fù)。為進(jìn)一步研究線粒體的的損傷情況,本研究中采用電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)的變化并進(jìn)行體視學(xué)分析,結(jié)果表明:模型組大鼠腦組織中細(xì)胞內(nèi)容物或腫脹或結(jié)構(gòu)重疊或者破裂,線粒體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象,多數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變,嵴結(jié)構(gòu)變形或者變少或者缺失,部分線粒體嵴因線粒體外室腫脹擴張,成為空泡樣嵴,線粒體基膜模糊,整個神經(jīng)元內(nèi)線粒體總數(shù)量明顯減少。治療組大鼠腦組織內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn),空泡樣變性明顯緩解,稍見腫脹,線粒體的數(shù)量明顯增多,結(jié)構(gòu)趨于正常,僅有部分線粒體輕度腫脹,線粒體嵴結(jié)構(gòu)的數(shù)目和形態(tài)也趨于正常,偶見線粒體嵴斷裂或消失。各組大鼠腦組織線粒體體視學(xué)分析結(jié)果表明,與sham 組相比,模型組大鼠細(xì)胞中腦組織中線粒體的體密度數(shù)值、比表面積、比膜面積以及數(shù)密度數(shù)值均明顯減小(P<0.05),說明模型組的線粒體損傷嚴(yán)重;與模型組相比,治療組腦組織中神經(jīng)細(xì)胞中線粒體的腦組織中線粒體的體密度數(shù)值、比表面積、比膜面積以及數(shù)密度數(shù)值均明顯增大(P<0.05),說明治療組的線粒體損傷有所恢復(fù)。

炎性反應(yīng)在TBI 進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。L-1β、IL-6 和 TNF-α 是最常見的炎性因子。有研究報道證明[19]rhEPO 能夠明顯抑制心臟、肺等臟器損傷后的炎性反應(yīng)。但未見有rhEPO 與腦損傷后炎性反應(yīng)的的關(guān)系的的報道。本研究采用免疫組化和Wetern blot 法檢測炎性因子的表達(dá),結(jié)果都表明,與sham 組相比,模型組大鼠腦組織細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 明顯升高(P<0.05),與模型組相比,治療組腦組織中細(xì)胞 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 明顯降低(P<0.05)。說明rhEPO 能明顯抑制TBI 后腦損傷的炎性反應(yīng)。

綜上所述,重組人促紅細(xì)胞生成素可以減輕創(chuàng)傷性腦損傷后的炎性反應(yīng),減輕線粒體損傷,從而發(fā)揮對創(chuàng)傷性腦損傷后的腦組織的保護(hù)作用。但如何將rhEPO 的這種保護(hù)作用于臨床上靶向治療創(chuàng)傷性腦損傷后的腦血管疾病,仍需進(jìn)一步的探索。