SHR 并高尿酸血癥降低尿酸血脂水平變化

田 飛張 春李 江

(1.烏魯木齊市友誼醫院內科,烏魯木齊 830049; 2.新疆醫科大學北校區動物實驗中心, 烏魯木齊 830011;3.中國科學院新疆分院圖書館,烏魯木齊 830011)

高血壓因其高發生率及同腦卒中的危險,心血管病,終末階段腎疾病,影響全部人群的全部死亡率的強相關性,高血壓成為全球重要的公共健康挑戰。以前研究表明循環中的高尿酸水平同高血壓的發生率增加和經常導致病人預后不良的心血管并發癥的高危險情況相關[1]高尿酸是心血管危險的一個生物標記物[2]血中尿酸和高血壓的相關性通過血脂調解[3]本研究觀察自發性高血壓大鼠(SHR)并高尿酸血癥降低尿酸干預血脂水平的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

50 只,SPF 級,近交系 SHR 雌雄各半,8 ～ 10 周齡,雄:180～260 g,雌:125～180 g,健康良好,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。動物飼養在SPF 級動物房,飼養溫度與濕度:22℃～24℃,45%～55%,動物模型制備及血脂檢測均在新疆醫科大學北校區動物實驗中心屏障動物實驗設施內進行[SYXK(新)2018-0003],整個動物實驗被新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理委員會批準(IACUC 20160414-08)。實驗研究過程中按實驗動物的使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

別嘌呤醇:化學名稱:C5H4N40, 劑量:5 g,單位:瓶,純度:>99%,批號:011M1681V,生產單位:美國Sigma 公司,貨號:A8003;腺嘌呤:化學名稱:C5H5N5,劑量:100 g,單位:瓶,純度:>99%,批號:021Mol81v,生產單位: 美國 Sigma 公司, 貨號:A8626;乙胺丁醇:化學名稱:C10H24N202.2HCL,劑量:100 g,單位:瓶,純度>99%,批號:109K1582V,生產單位:美國Sigma 公司,貨號:E4630;UA 試劑盒:化學式:無,貨號:C012,生產單位:南京建成,劑量:96T,單位:盒,純度:無,批號:20180202;VLDL試劑盒:化學式:無,貨號:CSB-E17088 r,生產單位:武漢華美,劑量:96T,單位:盒,純度:無,批號:X320119953; LDL-C 試劑盒:化學式:無,貨號:A113-1,生產單位:南京建成,劑量:96T,單位:盒,純度:無,批號:20180128;TG 試劑盒:化學式:無,貨號:110-1,生產單位:南京建成,劑量:96T,單位:盒,純度:無,批號:20180128;HDL-C 試劑盒:化學式:無,貨號:A112-1,生產單位:南京建成,劑量96T,單位:盒,純度:無,批號:20180128;T-CHO 試劑盒:化學式:無,貨號:A111-1,生產單位:南京建成,劑量:96T,單位:盒,純度:無,批號:20180202;酶標儀:型號:XMarKTM,規格:無,生產單位:美國Bio-Rad,精密度或誤差范圍:0.010 D 值,范圍:100～1000 nm。

1.3 實驗方法

1.3.1 研究時間

2018.05.20 -2018.07.08。

1.3.2 研究設計

實驗設計為完全隨機設計。

1.3.3 藥物配制使用

0.5% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的配置:取1000 mL 的蒸餾水,加熱至50℃～60℃,然后精密稱取5 g CMC-Na,多次少量的加CMC-Na,邊加邊攪拌,然后在沸水浴上加熱攪拌,到渾濁,再到澄清,然后冷卻到室溫,拿到離心機里面,離心,取上清液。

腺嘌呤混懸液的配置:用量筒量取25 mL 的0.5% CMC-Na 溶液,然后精密稱取1 g 腺嘌呤,加入CMC-Na 溶液中,混勻得到腺嘌呤混懸液;

乙胺丁醇混懸液的配置:用量筒量取40 mL 的0.5% CMC-Na 溶液,然后精密稱取2 g 乙胺丁醇,加入CMC-Na 溶液中,混勻得到乙胺丁醇混懸液;

別嘌呤醇混懸液的配置:用量筒量取25 mL 的0.5% CMC-Na 溶液,然后精密稱取100 mg 別嘌呤醇,加入 CMC-Na 溶液中,混勻得到別嘌呤醇混懸液;

腺嘌呤:150 mg/kg,溶于0.5%CMC-Na,濃度為15 mg/mL。

乙胺丁醇:250 mg/kg,溶于0.5%CMC-Na,濃度為25 mg/mL。

別嘌呤醇:10 mg/kg,溶于0.5%CMC-Na,濃度為1 mg/mL。

藥物使用: 給藥劑量為1 mL/100 g,給藥方法為每日早晨10 點灌胃一次。

1.3.4 動物模型制備

根據文獻報道的方法[4-5]制備SHR 并高尿酸血癥模型。根據文獻報道的方法確定降低尿酸藥物別嘌呤醇的劑量,SHR 別嘌呤醇劑量確定:人別嘌呤醇每日100 mg,體重按60 kg 計算,每公斤藥物劑量為,動物之間給藥劑量的計算按下面公式:A藥量(mg/kg)×AKm 因子=B藥量(mg/kg)×BKm 因子。式中:A和B分別代表兩種不同動物,不同動物有不同的Km 因子。成年人Km 因子為 37,大鼠 Km 因子為 6。SHR 藥量(mg/kg)×6=1.667×37;SHR 藥量(mg/kg)= 10.28 mg/kg≈10 mg/kg。

1.3.5 實驗分組

對照組(A1)(單純SHR 組)n=20,雌雄各半用等體積0.5%CMC-Na 灌胃[6]兩周。

SHR+高尿酸血癥組(B1)n=30 雌雄各半用腺嘌呤(150 mg/kg 溶于0.5% CMC-Na)和乙胺丁醇(250 mg/kg 溶于0.5% CMC-Na)灌胃兩周。繼續造模對照組(A2)(單純SHR 組)n=10(從對照組A1 隨機選取),雌雄各半,在A1組干預完成后再用等體積0.5%CMC-Na 灌胃,繼續灌胃5 周。SHR+高尿酸血癥繼續造模組(B2)n=10(從SHR+高尿酸血癥組B1,隨機選取),雌雄各半,在B1組干預完成后再用腺嘌呤(150 mg/kg 溶于0.5% CMC-Na)和乙胺丁醇(250 mg/kg 溶于0.5% CMC-Na)繼續灌胃5 周。SHR+高尿酸血癥+尿酸降低組(B3)n=10(從SHR+高尿酸血癥組B1,隨機選取),雌雄各半,在B1 組干預完成后再用腺嘌呤(150 mg/kg 溶于0.5% CMC-Na)和乙胺丁醇(250 mg/kg 溶于0.5%CMC-Na)和別嘌呤醇(10 mg/kg 溶于0.5%CMCNa)繼續灌胃5 周。

1.3.6 UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL 的檢測

在造模前,造模兩周,造模四周,造模七周分別從大鼠收集1.5～2 mL 血到普通采血管離心,分離血清500 μL,在-80℃保存,按照試劑盒操作方法進行測定,用酶標儀檢測 UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL.

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 模型建立前大鼠血清中血脂指標水平

模型建立前SHR 組與SHR 并高尿酸血癥組相比UA,TC,TG,HDL-C,LDL-C,VLDL 無明顯差異,統計學處理為兩獨立樣本t檢驗,P<0.05 表明有顯著性差異,見表1。

2.2 造模兩周大鼠血清中血脂指標水平

造模第二周SHR 并高尿酸血癥組與SHR 組相比,VLDL,HDL-C 有明顯差異。統計學處理為兩獨立樣本t檢驗,P<0.05 表明有顯著性差異,見表2。

2.3 造模4 周大鼠血清中血脂指標水平

造模第4 周,SHR 并高尿酸血癥組與SHR 組相比TC 明顯升高,統計學處理為單因素方差分析,P<0.05 表明有顯著性差異,見表3。

2.3 造模7 周大鼠血清中血脂指標水平

造模第7 周,SHR 并高尿酸血癥組與SHR 組相比VLDL,TC 明顯升高,統計學處理為單因素方差分析P<0.05 表明有顯著性差異,見表4。SHR 并高尿酸血癥降低尿酸組與SHR 并高尿酸血癥組相比,VLDL 明顯降低,統計學處理為單因素方差分析,P<0.05 表明有顯著性差異,見表4.

表1 模型建立前大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 1 Before established animal model the analysis of serum lipids levels of SHR

表1 模型建立前大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 1 Before established animal model the analysis of serum lipids levels of SHR

注:兩獨立樣本t 檢驗。下同。Note.Two independent samples t-test.The same as below.

組別Groups例數(n)Samples血極低密度脂蛋白(ng/mL)Serum very low density lipoprotein血高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum high density lipoprotein cholesterol血低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum low density lipoprotein cholesterol血膽固醇(mmol/L)Serum total cholesterol血甘油三酯(mmol/L)Serum triglyceride血尿酸(μmol/L)Serum uric acid自發性高血壓大鼠組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) group 20 17.174±1.664 0.437±0.284 0.854±0.325 0.830±0.513 0.522±0.235 49.283±7.938自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥組Spontaneouly hypertensive rat (SHR)With hyperuricemia group 30 17.410±1.468 0.431±0.214 0.785±0.503 0.795±0.264 0.452±0.233 53.705±7.797 t 值t value -0.529 0.078 0.814 0.210 1.032 -1.950 P 值P value 0.599 0.938 0.420 0.835 0.307 0.057

表2 模型建立兩周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 2 Established animal model for two week,the analysis of serum lipids levels of SHR

表2 模型建立兩周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 2 Established animal model for two week,the analysis of serum lipids levels of SHR

組別Groups例數(n)Samples血極低密度脂蛋白(ng/mL)Serum very low density lipoprotein血高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum high density lipoprotein cholesterol血低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum low density lipoprotein cholesterol血膽固醇(mmol/L)Serum total cholesterol血甘油三酯(mmol/L)Serum triglyceride血尿酸(μmol/L)Serum Uric acid自發性高血壓大鼠組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) group 20 12.337±2.833 0.569±0.351 0.841±0.321 1.094±0.326 0.526±0.185 63.315±7.512自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥組Spontaneouly hypertensive rat (SHR)With hyper-uricemia group 30 10.312±2.405 0.745±0.251 0.807±0.270 1.226±0.521 0.574±0.194 70.481±12.671 t 值t value 2.716 -2.074 0.399 -1.011 -0.872 -2.507 P 值P value 0.009 0.043 0.692 0.317 0.388 0.016

表3 模型建立4 周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 3 Established animal model for four weeks, the analysis of serum lipids levels of SHR

表3 模型建立4 周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 3 Established animal model for four weeks, the analysis of serum lipids levels of SHR

注:與SHR 組相比,▲P<0.05;與SHR+高尿酸血癥組相比,1P<0.05。單因素方差分析。下同。Note.Compared with the group of SHR, ▲P<0.05.Compared with the group of SHR with hyperuricemia, 1P<0.05.Analysis of variance of completely random design.The same as below.

組別Groups例數(n)Samples血極低密度脂蛋白(ng/mL)Serum very low density lipoprotein血高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum high density lipoprotein cholesterol血低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum low density lipoprotein cholesterol血膽固醇(mmol/L)Serum total cholesterol血甘油三酯(mmol/L)Serum triglyceride血尿酸(μmol/L)Serum uric acid自發性高血壓大鼠組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) group 10 10.062±2.723 0.714±0.329 0.863±0.190 0.848±0.362 0.575±0.156 69.762±13.460自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) With hyperuricemia group 9 9.484±3.386 0.560±0.531 0.921±0.271 1.273▲±0.351 0.710±0.261 83.796▲±11.152自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥+尿酸降低組Serum Uric acid-Lowering therapy of Spontaneouly hypertensive rat (SHR)with hyperuricemia group 10 11.741±2.257 0.663±0.286 0.903±0.194 1.161±0.534 0.588±0.119 72.556±9.5951

表4 模型建立7 周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 4 Established animal model for seven weeks,the analysis of serum lipids levels of SHR

表4 模型建立7 周,大鼠血清中血脂指標水平分析( ±s)Table 4 Established animal model for seven weeks,the analysis of serum lipids levels of SHR

組別Groups例數(n)Samp-les血極低密度脂蛋白(ng/mL)Serum very low density lipoprotein血高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum high density lipoprotein cholesterol血低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)Serum low density lipoprotein cholesterol血膽固醇(mmol/L)Serum total cholesterol血甘油三酯(mmol/L)Serum triglyceride血尿酸(μmol/L)Serum uric acid自發性高血壓大鼠組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) group 10 11.857±1.713 0.921±0.565 1.128±0.143 1.084±0.401 0.734±0.248 70.178±12.542自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥組Spontaneouly hypertensive rat (SHR) With hyperuricemia group 9 8.937▲±0.953 0.630±0.422 1.172±0.163 1.574▲±0.266 0.813±0.275 97.761▲±10.739自發性高血壓大鼠+高尿酸血癥+尿酸降低組Serum uric acid-Lowering therapy of Spontaneouly hypertensive rat (SHR) with hyperuricemia group 10 11.1751±1.748 0.909±0.365 1.108±0.092 1.462±0.545 0.694±0.289 76.092±7.8951

3 討論

本研究構建SHR 并高尿酸血癥降低尿酸動物模型觀察血脂水平變化,在造模第二周SHR 并高尿酸血癥組與 SHR 組相比 VLDL、HDL-C 有明顯差異,在造模第四周,SHR 并高尿酸血癥組與SHR 組相比TC 明顯升高,在造模第七周時SHR 并高尿酸血癥組與 SHR 組相比 VLDL、TC 明顯升高,SHR 并高尿酸血癥降低尿酸組與SHR 并高尿酸血癥組相比VLDL 明顯降低。

高尿酸是一個在脂肪組織中,內分泌不平衡的促炎介質,其是血脂不正常及導致動脈粥樣硬化的炎性過程的重要因素之一[7]。

血中尿酸水平與高身體脂肪之間的相關性機制不清楚,一個可能的解釋是果糖攝入,過多的果糖的消耗是飲食導致高尿酸血癥的原因。有證據果糖引起細胞內ATP 消耗,核苷酸轉換。并且尿酸產生。果糖誘發尿酸產生引起線粒體過氧化應激其另外有利于引起脂肪蓄積,有些研究表明,脂肪組織有豐富的黃嘌呤過氧化酶活性并且能產生和分泌尿酸;一些研究觀察到血中尿酸水平同TG 呈正相關。同HDL-C 呈負相關。血中尿酸水平和TG相關性不清楚。但有些可能的解釋,根據這些解釋之一,在肝尿酸能誘發脂質機制,并且能阻止脂肪酸過氧化。其他研究者提出脂肪酸肝合成同嘌呤從頭合成相關伴隨加速尿酸產生;根據 Johnson等[2]的研究表明尿酸可占有脂肪細胞在這里誘發過氧負荷,產生炎癥介質和抑制脂聯素合成[8]。

高血尿酸水平明顯同收縮壓相關,高TG 水平同舒張壓和收縮壓相關;高TG 或血中尿酸水平導致高血壓機制不明,幾個研究報道:高血尿酸水平在胰島素誘發的No 產生通過血管阻抗,誘發內皮功能失調,可能導致高血壓,另外高TG 水平也同胰島素抵抗強相關,通過增強交感神經系統反應性,激活腎素血管緊張素系統,并且刺激腎小管鈉重吸收,腎素血管緊張素系統激活不僅通過高血尿酸水平也通過高TG 水平,這兩個因素相互作用影響血壓,血中尿酸水平同炎癥,氧化應激強相關[9]。

有幾個研究報道了高尿酸血癥同血脂的相關性,在印度,意大利,美國成年人群,人血中尿酸水平同脂質譜有明顯的相關性[7]。Ferreira 等[8]所做的研究為:在健康年輕人和中年成年人中評估血尿酸水平同心血管代謝危險因素的相關性,入選樣本149 個,Brazilian 成年人年齡 20 ～ 55 歲,男、女兩性均調整混雜因素,血尿酸水平同低密度脂蛋白膽固醇,甘油三酯呈正相關,同高密度脂蛋白膽固醇呈負相關。研究表明:血中高尿酸水平同身體過多脂肪細胞和脂質譜代謝異常呈相關性。

Cheng 等[10]所做的研究為檢查在沒有糖尿病的人群中,血中尿酸水平同心血管病危險的相關性。入選樣本8252 人,年齡為大于40 歲。沒有糖尿病的來自于中國上海嘉定區,研究結果表明:較高四分之一尿酸水平與最低四分之一尿酸水平相比,對于較高的血脂代謝異常發生有預測價值。Zhang 等[11]所做的研究為回顧性分析體檢數據,入選樣本中國開封24438 人,男 12557 人,女 11881人。結果表明:在男女兩性中高甘油三脂同高尿酸血癥呈正相關。這種相關性,尤其在與年齡相關的婦女中明顯。Shi 等[12]所做的研究為橫斷面研究在中國東北,入選樣本6466 人,結果表明:甘油三酯-血糖指數和高尿酸血癥危險性呈線性和強有力相關。在高尿酸血癥的防治中,血糖和血脂同時控制是重要的,甘油三酯一血糖指數優化危險分層和防治高尿酸血癥有重要價值。

Cheng 等[10]研究為在沒有糖尿病的中國成人中,10 年Framingham 冠心病危險研究和10 年動脈粥樣硬化心血管病研究血中尿酸水平同肥胖,高血壓,脂質異常發生率的危險性增加相關。

Cao 等[3]所做的研究為:通過人群縱向研究在中國人群中代謝混雜因素調整后,升高的血中尿酸濃度獨立的與新發生的高血壓相關。肥胖,血脂,血糖在高尿酸血癥所致高血壓的發生發展通路中起重要的調節作用。

血中高尿酸水平增加血脂異常,尿酸可歸于血脂異常的進展,血中尿酸水平升高明顯同血脂異常和它的成分相關,這種關系受年齡和性別影響[13]。

血脂異常與無癥狀的高尿酸血癥相比在痛風的病人中更常見。在痛風中,HDL-C 是血中尿酸水平的保護性預測因子[14]。

研究表明調整可能的混雜因素:整個血膽固醇、甘油三酯、LDL-C 水平的血脂異常成份同血中尿酸水平呈正相關。血HDL-C 水平同血中尿酸水平呈負相關[15]。

年齡3 ～19 歲的高血壓兒童中,一年前瞻性觀察研究。通過橫斷面縱向研究探索血尿酸水平同心血管危險因素相關性。血中尿酸水平升高的高血壓兒童有與心血管病危險因素相關的較高的肥胖發生率。較低高密度脂蛋白膽固醇同基線升高的血尿酸水平明顯相關[16]。

橫斷面研究樣本:144856 年齡20 ～79 歲,比老年人超重或肥胖的個人,年輕人更易發展成高尿酸血癥。超重/肥胖一般被認為是高尿酸血癥的危險因素,較高的體重指數(BMI)是同血尿酸水平升高相關,臨床研究發現較高體重指數(BMI)也同升高的血尿酸水平相關。重量減少伴隨血中尿酸濃度減少。在流行病學研究中,血中尿酸水平同BMI 的關系已建立[17]。

在2 型糖尿病病人中,高尿酸血癥發生率同升高的甘油三酯濃度,高甘油三酯/高密度脂蛋白膽固醇比值相關[18]。

在許多研究中,在成年人和兒童中高血中尿酸濃度同較高的血壓的相關已報道,高血中尿酸濃度同血脂異常相關已表明是低HDL-C 水平而不是增加LDL 或VLDL 水平的結果。研究證實升高的血中尿酸同低HDL-C 和高甘油三酯相關[19]。

人群群體研究表明血中尿酸水升高與血脂異常相關。血中尿酸水平同TC、TG、LDL-C 呈正相關與HDL-C 呈負相關。在SHR 并高尿酸血癥降低尿酸動物模型構建過程中觀察血脂變化,TC 的變化與人群群體研究的變化相一致,這為原發性高血壓合并高尿酸血癥,降低尿酸,降低血脂提供理論依據,造模第七周時SHR 并高尿酸血癥組與SHR 組相比VLDL 升高,別嘌呤酸降低血中尿酸水平VLDL 也降低。今后需在人群群體中做隨機對照研究,觀察原發性高血壓并高尿酸血癥,降低血中尿酸水平,血脂水平的變化。為原發性高血壓并高尿酸血癥脂質代謝異常參與發生機制提供理論依據。

麻醉深度是動物實驗過程中造成偏倚的因素,在動物實驗第4 周SHR 并高尿酸血癥組一只大鼠因麻醉過深導致死亡,造成對動物實驗結果的影響,這是本動物實驗的局限性。

替換、減少、優化3R 原則是世界范圍內動物實驗共同遵守的原則,在本動物實驗中保定大鼠遵循溫和保定、善良撫慰,減少動物病痛和應激反應,優化改進,完善動物實驗程序。

任何一種動物模型都不能全部復制人類疾病的所有表現,動物畢竟不是人體,模型實驗只是一種間接性研究。只可能在一個局部或一個方面與人類疾病相似,所以模型實驗結論的正確性是相對的,最終還必須在人體上得到驗證,復制過程中一旦發現與人類疾病不同的現象,必須分析差異的性質和程度,找出異同點,以正確評估[20]。