黃芩苷抗生物膜作用研究進展

韓佳慧， 劉唐娟， 羅 勁， 溫中薇， 黃海珠， 張 珂， 蔣玉婷， 陳一強

(廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021)

隨著醫學科學的發展，越來越多的醫療器械和人造器官等植入物用于治療各種疾病，據報道，絕大多數的醫療器械或人造器官會導致生物膜相關的感染，包括導尿管、假牙、人工心臟瓣膜和假肢等[1]。生物膜的形成最初被認為是微生物的一種神秘行為，是微生物主要的生活方式。現定義為一個相互作用的微生物群落，緊密地、不可逆地錨定在一個表面，并嵌入到由胞外聚合物(EPS)組成的基質中[2-3]。通常治療濃度下的抗生素無法根除生物膜結構深處的細菌/真菌，針對生物膜的抗生素療法一般療程長、劑量高，過度使用抗生素將引起抗生素耐藥性的傳播，隨著多重耐藥(MDR)、廣泛耐藥(XDR)和全耐藥(PDR)病原體的出現，世界正處于后抗生素時代的邊緣，這將使醫學重新陷入黑暗時代，因此迫切需要開發能夠調節生物膜形成和發育的新型抗菌劑，以克服微生物感染性疾病中的耐藥問題[4-5]。近年來的研究表明中藥及其活性成分能抑制生物膜的形成和發育，如五倍子水煎劑可抑制鮑曼不動桿菌生物膜形成；土荊芥提取物可抑制幽門螺桿菌生物膜形成；桑黃正丁醇提取物可抑制白念珠菌生物膜形成；隱丹參酮可抑制表皮葡萄球菌生物膜等[6-10]。關于中藥活性成分抑制生物膜形成已有大量報道，其中黃芩作為現代藥理學研究的熱點，其活性成分黃芩苷也成為近些年研究的明星化合物。

黃芩始載于《神農本草經》，別名山茶根、土金茶根，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，味苦，性寒，歸肺、膽、脾、小腸、大腸經，其有效成分是黃酮類化合物，主要包括黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogomin)、黃芩新素I(skullcapflavone I)、黃芩新素Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)[11]。黃芩苷是黃芩的藥效物質基礎，也是黃芩質量控制的主要植物化學標志，具有抗病毒、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、保肝、利膽、免疫調節等多種藥理作用，尤以抗真菌/細菌作用最為顯著[12]。本文將近年來黃芩苷抗生物膜作用的研究進展進行綜述，以期進一步深入挖掘其在抗生物膜方面的潛在價值，為治療生物膜相關感染提供新的治療策略。

1 抗細菌生物膜

生物膜的形成是一個復雜的發育過程，主要分為初始粘附階段、早期生物膜形成階段、生物膜成熟階段、擴散與再定植階段[13]。生物膜的形成是細菌引發慢性感染的關鍵毒力因子，為細菌提供了有利于生存的惰性環境，由于細菌特有的生活方式賦予了其固有的抗生素抗性，因此治療生物膜相關感染成為全球面臨的一大挑戰[14]。大量研究表明中藥黃芩活性成分黃芩苷具有抑制細菌生物膜的作用。

1.1 抗金黃色葡萄球菌生物膜 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, Sa)是革蘭氏陽性菌，常分為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)，主要存在于皮膚和黏膜的正常菌群中[15]。金黃色葡萄球菌能形成成熟的生物膜，與浮游細菌相比，生物膜內的細菌對抗生素的耐受性可以高出1 000倍[15]。本課題組利用臨床分離并且能夠穩定形成生物膜的金黃色葡萄球菌，研究黃芩苷對金黃色葡萄球菌早期、成熟生物膜的抑制作用，采用TSB-G系統構建體外生物膜模型，實驗測得黃芩苷對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為2 048 μg/mL，黃芩苷可減少金黃色葡萄球菌對載體的黏附，抑制和清除金黃色葡萄球菌生物膜，同時還能抑制新的生物膜形成[16-17]。在后期研究中發現黃芩苷與抗生素具有協同增效作用，黃芩苷與頭孢他啶[18]、頭孢唑林[19]、左氧氟沙星[20]、萬古霉素[21]等聯用，能加速破壞生物膜的結構，增強抗生素的滲透以及對細菌的清除作用，顯示出了協同殺菌作用，與其干擾了細菌群體感應(Quorum Sensing, QS)系統密切相關。在觀察黃芩苷與左氧氟沙星聯用抗生物被膜感染的療效時，發現黃芩苷作為QS抑制劑，在體外可提高金黃色葡萄球菌熱核酸酶的產量，下調agrA的表達，通過agr系統來調節金黃色葡萄球菌的毒力因子[22]。基于這些研究，黃芩苷可作為治療金黃色葡萄球菌生物膜相關感染的候選藥物，與抗生素聯用可作為新的、可行的治療策略。

1.2 抗銅綠假單胞菌生物膜 銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是機會性致病菌，是囊性纖維化患者持續性和頑固性感染的主要原因[23]。

謝林利等[24]發現黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，對早期生物膜的抑制作用強于成熟生物膜。王貴年等[25-26]選取臨床分離的銅綠假單胞菌，研究黃芩苷在體外對銅綠假單胞菌生物膜的影響，結果發現濃度為15.65 mg/L的黃芩苷可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，并增強頭孢他啶對生物膜內銅綠假單胞菌的清除作用。Brackman等[27]在探索群體感應抑制劑(QSI)在體內外增加抗生素對細菌生物膜的敏感性研究中，發現黃芩苷通過增加妥布霉素 (TOB)對銅綠假單胞菌生物膜的敏感性來抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，但敲除參與QS調控的rhlI基因、lasI基因后，黃芩苷不能增加TOB對銅綠假單胞菌生物膜的敏感性，進而說明黃芩苷可通過影響群體感應系統提高抗生素對細菌生物膜的抑制與清除作用。Luo等[28]發現黃芩苷在體內外均可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，對QS通路調控的與生物膜形成相關的基因有明顯的抑制作用，亞MIC黃芩苷處理后，LasI、LasR、rhLI、rhLR、pqsR和pqsA基因的表達均下調，從而使QS信號分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL的表達顯著降低，體內實驗表明，黃芩苷處理后不僅可降低銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲的致病性，在小鼠腹腔植入感染模型中，黃芩苷處理后，還提高了感染銅綠假單胞菌的小鼠對銅綠假單胞菌的清除能力。李少濱等[29]取銅綠假單胞菌 PAO1標準株，用黃芩苷對銅綠假單胞菌 PAO1生物膜的體外培養進行干預，結果顯示黃芩苷不僅抑制生物膜的形成，還降低多糖蛋白復合物的產量，抑制mRNA的表達效果，同時也說明黃芩苷抑制生物膜生成的機制存在多靶點，具體的作用機制仍需深入探索。

1.3 抗其他細菌生物膜 變形鏈球菌 (Streptococcusmutans, Sm) 是引起口腔致齲的主要致病菌。劉連等[30]發現黃芩苷、黃芩素對變形鏈球菌無直接殺滅作用，但可顯著抑制其生物膜的形成，有利于避免細菌抗藥性的產生。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg) 是慢性牙周炎最常見的致病菌，張廣平[31]采用PVC吸痰管作為載體建立體外生物膜模型，實驗測得32.25 mg/L的黃芩苷可抑制和破壞牙齦卟啉單胞菌生物膜，其抑制機制可能通過抑制細菌的黏附作用。

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis, Ef)是普遍存在于人體的腸道和口腔中的正常菌群，由于其以生物膜的形式定植于根管中，所以成為再治療根管中常見的難治性問題。付爽等[32]測得黃芩苷對糞腸球菌的MIC為2 mg/mL，MBC為4 mg/mL，共聚焦顯微鏡觀察膜內活菌和死菌比例明顯下降，提示黃芩苷可抑制糞腸球菌生物膜的形成。

洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia, Bc)是一種革蘭陰性非發酵桿菌，廣泛存在于自然和醫療環境中，洋蔥伯克霍爾德菌感染會加速囊性纖維化(CF)患者肺功能衰竭，同時會增加死亡率[33]。Slachmuylders等[34]在實驗中發現與單獨使用妥布霉素相比，同黃芩苷聯用后會增加洋蔥伯克霍爾德菌生物膜的氧化壓力，也可增強洋蔥伯克霍爾德菌對妥布霉素的敏感性，使妥布霉素介導的殺傷力增加。這種增強作用與氧化應激反應有關，使活性氧的產生增多。

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii, Cs)是近些年新分類出的一種機會性病原體，為腸桿菌科克羅諾桿菌屬，常導致嚴重的感染并發癥，如新生兒腦膜炎、尿路感染、敗血癥和癲癇等，阪崎克羅諾桿菌能在各種生物及非生物表面形成生物膜。景春娥等[35]測得2 048 mg/L黃芩苷能夠通過降低阪崎克羅諾桿菌的粘附性，下調阪崎克羅諾桿菌生物膜相關基因(glpQ、nlpD、gsiB、deoB)來抑制生物膜的形成。

Wang等[36]發現黃芩苷還能有效地抑制腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus, Ss)生物膜的形成及agr系統，具體機制是通過抑制Msra外排泵，外排泵與生物膜的形成之間呈顯著的正相關。黃衍強等[37]發現黃芩苷對耐藥幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)有抑制作用, 濃度<50%MIC能明顯抑制菌株生物膜的形成。

2 抗真菌生物膜

真菌可以單獨或與細菌一同形成生物膜，真菌生物膜的形成與細菌相似，真菌生物膜是由附著在表面上的細胞和菌絲組成的復雜群落，并嵌入細胞外基質中。近年來，與生物膜相關的侵襲性真菌感染病例不斷增多，尤以白色念珠菌和煙曲霉菌感染率最高，生物膜的形成參與了侵襲性真菌感染的致病過程，因此被認為是重要的毒力因子[38]。目前只有幾類抗真菌藥物用于治療真菌感染，而新型抗真菌藥物的開發進展緩慢，故從中藥中挖掘具有抗生物膜作用的中藥活性成分顯得尤為重要。我國具有豐富的中藥資源，其中有不少中草藥已被證明具有抗真菌生物膜作用，如中藥黃芩活性成分黃芩苷[39]。

2.1 抗白色念珠菌生物膜 念珠菌是引起侵襲性真菌感染最常見的病原菌，其中白色念珠菌(Candidaalbicans, Ca)是引起侵襲性念珠菌病的主要病原體。白色念珠菌是口腔或胃腸道中的共生菌，然而當機體免疫功能嚴重受損時，這種真菌可以傳播到血液中并定植于內臟，導致危及生命的感染[40]。白色念珠菌生物膜是一種復雜的結構，包含酵母狀細胞、假菌絲細胞和菌絲細胞，這些細胞被包裹在細胞外基質中，細胞外基質對抗真菌藥物起著物理屏障的作用，現有的抗真菌藥物在對浮游菌有效的濃度下，對生物膜中的白色念珠菌基本上無效，雖然高濃度的藥物可清除生物膜結構深處的白色念珠菌，但這些劑量往往會對宿主產生嚴重的副作用(即腎臟或肝臟損傷)[41-42]。黃芩及其有效成分對浮游狀態的白色念珠菌的抑制作用已有大量報道，黃芩苷具有抑制白色念珠菌生物膜形成的作用。

李福明等[43]研究黃芩苷在體外對白色念珠菌生物膜形成的影響，結果顯示黃芩苷可抑制白色念珠菌生物膜的形成，在質量濃度為8.0 mg/mL時，白色念珠菌生物膜活性降低(90.6±5.2)%，生物膜生物量減少(90.3±2.6)%。黃芩苷在抗白色念珠菌生物膜時與氟康唑具有協同增效作用。顏貴明等[44]發現黃芩苷聯合氟康唑時對白色念珠菌生物膜的抑制作用加強，通過下調白色念珠菌生物膜相關基因(ALS1、ALS3、EAP1和SUN41)的表達，降低細胞表面疏水性調控基因CSH1，從而減弱白色念珠菌的毒力，發揮協同抗白色念珠菌生物膜的作用。

Wang等[45]研究黃芩苷對白色念珠菌生物膜的潛在作用機制時，發現黃芩苷不僅與氟康唑具有明顯的協同作用，還可能逆轉了白色念珠菌對氟康唑的耐藥性，同時在黃芩苷處理的白色念珠菌生物膜中觀察到細胞內活性氧(ROS)積累，線粒體膜電位(MMP)降低，磷脂酰絲氨酸(PS)外化，染色體凝聚，細胞核碎裂，細胞色素C(Cytc)釋放等凋亡相關的現象；通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)發現黃芩苷處理后RAS1/TPK1上調、CAP1/PDE2下調，這四個基因與Ras-cAMP-PKA通路相關，該通路調控著白色念珠菌的凋亡。關于細胞凋亡在黃芩苷抗白色念珠菌生物膜中的作用機制仍需進一步探討。

2.2 抗非白色念珠菌生物膜 汪長中等[46]研究了黃芩苷對光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌生物膜的作用，測得黃芩苷對4種非白念珠菌生物膜的SMIC50分別是 1 000、500、125、250 mg/L，SMIC80均≥1 000 mg/L，具有體外抗非白念珠菌生物膜的功能。因此，針對臨床上可能發生念珠菌生物膜感染疾病的患者，在未出現感染或感染的早期階段應用黃芩苷具有重要的防治意義。

3 結語

廣譜抗菌藥的使用，導致了大量耐藥菌株的出現，生物膜的形成增強了微生物對不利因素的抵抗能力。中藥在防治細菌/真菌生物膜相關感染方面有其獨特的優勢，黃芩為中醫臨床常用藥，具有廣泛的藥理作用和重要的臨床應用價值，黃芩苷可通過抑制細菌或真菌的粘附、下調生物膜形成相關基因，抑制群體感應系統、調控細胞凋亡、改變細胞膜通透性等多種途徑達到抑制生物膜形成的作用，與抗生素聯用還具有協同增效作用和逆轉耐藥性的作用。盡管黃芩苷抗生物膜作用已取得一定的進展，但仍需深入的研究其作用機制，以明確其抗生物膜作用的靶點，通過對中藥黃芩活性成分黃芩苷抗生物膜作用的系列研究，從而建立一種模式，以延伸到其他中藥對生物膜抑制作用的研究中，更好地促使中藥在這一領域的開發，為研發新型抗菌藥物開辟新途徑，為臨床防治生物膜相關感染策略提供參考。目前市面上的黃芩苷新型制劑主要有納米制劑、固體分散體、脂質體制劑、 磷脂復合物、β-環糊精包合物、金屬配合物等，但臨床上應用于生物膜相關感染的黃芩苷制劑比較少，今后應將該成分基礎研究轉化為臨床效益，研發出抗生物膜制劑，充分發揮其特色優勢，使廣大患者獲益。