羊棲菜多糖對3T3-L1 脂肪細胞脂代謝的影響及其機制

張杰，楊旭東★，石杰，楊驕霞，王桂云，宋高臣

（1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

羊棲菜是一種隸屬于褐藻門的食用海藻，富含氨基酸、維生素和多糖等，其重要成分羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）是一種具有多種生物活性的物質，具有抗氧化、抗衰老、抑制腫瘤、降血脂等作用[1-3]。本課題組前期動物實驗發現，SFPS 具有改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[4-5]，但其對體外脂肪細胞的增殖及糖脂代謝的影響及其機制未見報道。本實驗進一步觀察羊棲菜多糖對3T3-L1 脂肪細胞脂代謝的影響并初步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

羊棲菜多糖由牡丹江醫學院中心實驗室提供；3T3-L1 前脂肪細胞（美國ATCC 公司）；DMEM 高糖培養液、胎牛血清（美國Gibco 公司）；DOMO、MTT試劑（Sigma 公司）；胰蛋白酶、引物核苷酸片段（上海生工），其他試劑為國產分析純。

1.2 主要儀器和設備

CO2恒溫培養箱（美國G.S.公司）；PCR 儀（德國，Biometra）；紫外分光光度計（上海元析）；酶標儀（美國Biotek公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；PCR 儀（德國，Biometra）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

3T3-L1 前脂肪細胞培養條件[6]，37℃飽和濕度，5%CO2環境，10%胎牛血清DMEM 高糖培養液（鏈霉素100mg/L、青霉素100IU/L）培養。

1.3.2 胰島素抵抗模型建立

待分化細胞37℃飽和濕度，5%CO2培養箱，DMEM培養基中加入誘導液1（10μg/mL 胰島素、0.5mmol/LIBMX、1mmol/mL 地塞米松）培養2d。棄上清，DMEM培養基中加入誘導液2（10mg/L 胰島素），培養2d。更換DMEM 培養基，37℃，5%CO2培養箱，培養9d，細胞接近圓形，脂滴明顯聚集，細胞分化完成。分化成熟的3T3-L1 脂肪細胞分為對照組（高糖DMEM 培養基）和模型組（1mmol/mL 地塞米松），96h 后，GOD-POD方法測定培養基中葡萄糖消耗量確定模型是否成功。

1.3.3 胰島素抵抗細胞葡萄糖消耗量、甘油三酯和游離脂肪酸的測定

造模成功細胞分為3 組：模型組、SFPS 100mg/L 組 和SFPS 200mg/L 組，另 設 分 化 成 熟3T3-L1 脂肪細胞為正常對照組。上述各組繼續培養48h 后，按照試劑盒說明測定葡萄糖消耗量（glucose consumption，Glu）、游離脂肪酸（Free fatty acid，FFA）的生成量和細胞中甘油三酯（triglyceride,TG）含量。

1.3.4 MTT 法檢測細胞相對增殖率

正常對照組、模型組、SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組細胞，每組6 個平行孔，分別培養24h、48h、72h，加入MTT（5g/L）20μL，孵育4h，棄上清，加150μL DMSO，完全溶解，輕微振蕩12min。酶標儀570nm 測光密度（OD）值，并計算細胞相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR）。RGR（細胞相對增殖率）＝實驗組OD 值／對照組OD 值×100%

1.3.5 RT-PCR 檢測3T3-L1 細胞中GLUT-4、HSL的mRNA 表達情況

各組細胞棄培養液，Trizol 法提取3T3-L1 細胞細胞總RNA，鑒定RNA 純度后逆轉錄生成cDNA。PCR 反應條件：預變性95℃60s，變性95℃15s，復性60℃25s，延伸72℃45s，共40 個循環，引物序列，見表1。凝膠成像系統分析，分別計算GLUT-4/β-actin 和HSL/β-actin 的灰度比值。

表1 GLUT-4、HSL 的引物序列

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 SFPS 對3T3-L1 細胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量的影響

造模細胞分別培養24h、48h、72h，與對照組比較，培養48h、72h 的模型組細胞培養基中葡萄糖濃度顯著升高(P＜0.01)，表明細胞對葡萄糖的消耗量顯著降低，見表2。

表2 3T3-L1 細胞培養基中葡萄糖濃度（，n=6，mmol/L）

表2 3T3-L1 細胞培養基中葡萄糖濃度（，n=6，mmol/L）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 SFPS 對胰島素抵抗3T3-L1 細胞糖脂代謝的影響

由表3 可知，與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組也能顯著增加胰島素抵抗3T3-L1細胞葡萄糖消耗量的量 (P＜0.01)。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組也顯著降低胰島素抵抗3T3-L1 細胞生成FFA 的量(P＜0.01)。

表3 SFPS 對胰島素抵抗3T3-L1 細胞中糖脂代謝的影響（，n=6）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

2.3 SFPS 對胰島素抵抗3T3-L1 細胞相對增殖率的影響

與正常對照組比較，模型組胰島素抵抗3T3-L1細胞24h，48h 和72h 相對增值率降低（P＜0.01，P＜0.05），24h，48h 細胞相對增殖率降低顯著（P＜0.01）。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組能提高胰島素抵抗3T3-L1 細胞相對增值率，提高細胞活力，24h 細胞和48h 細胞相對增值率顯著增加（P＜0.01），見表4。

2.4 SFPS 對3T3-L1 細胞中GLUT-4、HSL mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組胰島素抵抗3T3-L1 細胞GLUT-4 mRNA 表達顯著降低，HSL mRNA 表達顯著增加（P＜0.01）（見表5，圖1、2）。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組GLUT-4mRNA 表達顯著增加，HSL mRNA 表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）（見表5，圖1、2）。

表4 SFPS 對胰島素抵抗3T3-L1 細胞相對增殖率的影響（,n=6）

表4 SFPS 對胰島素抵抗3T3-L1 細胞相對增殖率的影響（,n=6）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01，* P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

表5 SFPS 對3T3-L1 細胞中GLUT-4、HSL mRNA 表達的影響（，n=6）

表5 SFPS 對3T3-L1 細胞中GLUT-4、HSL mRNA 表達的影響（，n=6）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01，* P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

圖1 各組細胞GLUT-4 基因表達

圖2 各組細胞HSL 基因表達

3 討論

2 型糖尿病是一種復雜糖脂代謝紊亂的慢性疾病，以糖耐量異常、脂質代謝異常為特征的胰島素抵抗貫穿于2 型糖尿病的始終。胰島素抵抗是指各種原因引起的外周組織對胰島素的敏感性降低，利用葡萄糖不足[7]，主要累及肝臟、脂肪、肌肉等組織，其中脂肪組織分泌的脂肪因子在機制中占重要地位[8-9]。SFPS 是羊棲菜中的多糖成分，具有抗菌、增強免疫力，調節脂代謝等作用[10-11]，因此，本實驗進一步研究SFPS 對3T3-L1 細胞胰島素抵抗的作用并初步探討其作用機制。

葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）是組織細胞利用調節葡萄糖的重要蛋白，家族重要成員GLUT4 在脂肪、肝臟等組織中均有表達，GLUT4 蛋白將細胞外葡萄糖轉運到細胞內[12-13]，對胰島素反應敏感。已有研究顯示，胰島素抵抗的脂肪細胞膜上GLUT4 表達減少，與胰島素抵抗密切相關[14-15]。為了研究SFPS 對3T3-L1 細胞胰島素抵抗的影響，造模成功的細胞培養液中加入不同濃度的SFPS。本研究中，與模型組比較，SFPS 100 和200 mg/L 組細胞中GLUT4mRNA 的表達量顯著增加，表明SFPS 可通過增加GLUT4mRNA 的表達，改善3T3-L1 中胰島素抵抗。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)是脂肪分解的限速酶之一，在脂肪組織中受多種激素的調控，主要催化甘油三脂分解為甘油和脂肪酸[16]。為了研究SFPS對3T3-L1 細胞中甘油三酯分解利用的影響，造模成功的細胞培養液中加入不同濃度的SFPS。本研究中，與模型組比較，SFPS 100 和200 mg/L 組細胞中HSL mRNA 的表達量顯著降低，表明SFPS 可通過降低HSL mRNA 的表達，抑制3T3-L1 中脂質的分解利用。

本研究結果顯示：①SFPS 能顯著增加胰島素抵抗3T3-L1 細胞葡萄糖消耗量，顯著降低胰島素抵抗3T3-L1 細胞生成FFA 的量。②SFPS 能顯著增加GLUT-4 mRNA 的表達，顯著降低HSL mRNA 的表達。實驗結果提示，SFPS 改善3T3-L1 脂肪細胞胰島素抵抗的分子機制可能與調控GLUT-4 和HSL mRNA 的表達有關。