自建MALDI-TOF MS霉菌數據庫的研究*

李艷君，孫釗坤，丁賠賠，王姣賢，董 蓉，趙強元

解放軍總醫院第六醫學中心檢驗科，北京 100048

近年來，隨著腫瘤、艾滋病等免疫受損患者的增多，免疫抑制劑及廣譜抗菌藥物的長期使用，以及介入治療手段的開展，真菌感染發病率呈上升趨勢，尤其是侵襲性真菌感染，是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-3]。真菌感染病原的快速鑒定對于臨床及時實施抗真菌目標治療、降低患者病死率至關重要。近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)突破傳統方法的鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得到廣泛應用[4-6]。但對于真菌中的霉菌而言，MALDI-TOF MS存在鑒定能力不足的問題[7-8]，其原因之一是霉菌菌絲結構細胞壁較厚，導致菌體蛋白釋放不充分，而更主要的原因是儀器商品化的霉菌數據庫包含的菌種資源較少，缺少可供鑒定的比對數據。本研究通過收集臨床來源的各類霉菌，建立本地化MALDI-TOF MS霉菌數據庫，目的在于提高霉菌的鑒定能力，從而為臨床霉菌感染病原的快速檢測和患者的及時治療提供幫助。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 266株臨床霉菌分離自2018年1月至2019年4月本院臨床送檢的各類標本，包括痰液、肺泡灌洗液、膿液、組織標本等，所有標本以三區劃線方式接種至沙保羅培養基，28 ℃培養48 h左右，挑取肉眼可見的單個菌落，以點種方式接種至沙保羅培養基進行純培養，28 ℃培養48 h后每日觀察菌落生長狀況，根據不同種類絲狀真菌生長速度不同，適當延長培養時間，以菌落直徑達到1.5 cm時結束培養，進行后續試驗。

1.2儀器與試劑 德國Bruker公司的Microflex系列MALDI-TOF質譜儀及配套分析軟件FlexControl 3.4和Biotyper 3.1；美國ABI梯度PCR儀；上海一恒MJ-Ⅱ霉菌培養箱；質譜儀配套甲酸及基質液；日本Sigma公司真菌DNA提取試劑盒、PCR反應試劑；法國梅里埃沙保羅真菌培養基。

1.3方法

1.3.1基于18S rDNA 測序的菌種鑒定 純培養菌落用異丙醇沉淀法提取基因組DNA，擴增引物序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應體系為30.0 μL(DNA模板1.0 μL，上下游引物各3.0 μL，緩沖液 3.0 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.2 μL，水17.8 μL)；擴增條件為95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35循環，72 ℃ 10 min。擴增產物上機測序，序列結果登錄美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站進行比對，明確菌種。

1.3.2采集蛋白譜圖 純培養霉菌菌落應用甲酸萃取法提取蛋白，吸取1 μL上清液，滴加到MALDI靶板上，每株菌制備到8個靶位，晾干后滴加 HCCA基質溶液，干燥后上機檢測。打開FlexControl 3.4軟件采集譜峰：每個靶位采圖3張，每張圖轟擊100次激光，將獲得的24張圖譜在Flexanalysis中打開，除去低質量的圖譜。將>20張的有效圖譜在Biotyper 3.1中打開，若<20張有效圖譜則重復試驗，按照18S rDNA測序鑒定結果輸入菌株名稱，指定路徑和目錄完成建庫過程。

1.3.3數據庫的驗證 56株霉菌分別用商品化數據庫、自建數據庫和擴展數據庫(商品化數據庫+自建數據庫)進行菌種鑒定，與18S rDNA擴增測序鑒定結果進行比較，結果一致為鑒定正確，否則為鑒定錯誤。并記錄鑒定分值，根據儀器提供的分值判斷：>2.0分為可信的菌種水平鑒定；1.7～2.0分為可能的菌種水平鑒定；<1.7分為不可靠的鑒定。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析處理，應用MALDI-TOF MS配套的FlexControl軟件收集蛋白譜圖，采用Biotyper軟件構建評價數據庫。計數資料以例數或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1自建數據庫霉菌菌種信息及質譜圖容量 210株霉菌經18S rDNA 擴增測序后，6株出現雙峰或測序失敗，故204株霉菌用于數據庫的構建。自建霉菌數據庫中共包含19個菌屬，67個菌種，204株臨床常見霉菌的質譜圖及菌株詳細信息見表1。曲霉屬在數據庫中占比最高(33.8%)，共69株，包含15個常見菌種，其中7種為商品化數據庫未包含的菌種。除商品化數據庫和自建數據庫中共有的菌種以外，加入自建數據庫后，目前擴展數據庫共包括53個菌屬，169個菌種，569株霉菌的質譜圖，與原商品化數據庫比較，增加了10個菌屬，42個菌種，共204個質譜圖，包括籃狀菌、小穴殼菌屬、雙膜菌、亞隔孢殼屬、外瓶霉、耙齒菌、派倫霉屬、棘殼孢、絲孢菌和子囊菌屬。見表2。

表1 自建霉菌數據庫的菌種信息

續表1 自建霉菌數據庫的菌種信息

表2 各數據庫霉菌質譜圖容量比較(n)

2.2數據庫驗證

2.2.1驗證菌株 選取臨床霉菌分離株56株，經18S rDNA擴增測序后明確菌種，包含12個菌屬，29個菌種，各菌種株數及鑒定結果見表3。

表3 56株用于數據庫驗證的菌株信息

2.2.2數據庫鑒定結果 4株雜色曲霉有1株鑒定錯誤，其余3株的鑒定分值<1.7分。鑒定正確株數、正確率及鑒定分值分布數據見表4。商品化數據庫與擴展數據庫的鑒定正確率經χ2檢驗，差異有統計學意義(χ2=58.35，P<0.05)。

表4 數據庫鑒定結果

3 討 論

霉菌是真菌中的一大類，在臨床上可引起各類侵襲性感染，以呼吸系統感染最為多見[9]。感染者多為免疫受損或接受各種侵入性操作的患者，臨床治療困難，病死率較高[8]。病原的快速診斷對于搶先治療、提高治愈率至關重要。目前，對于霉菌的鑒定通常采用形態學方法，而霉菌體外培養生長緩慢，形態學鑒定對于檢驗人員技術能力要求較高，所以需要開發更加快速準確的檢驗技術以適應臨床需要。

近年來，MALDI-TOF MS被越來越廣泛地應用于臨床各類病原鑒定，但對于霉菌而言，仍存在鑒定能力不足的問題，其主要局限于商品化數據庫的菌株信息有限。有研究報道，通過增加數據庫容量，能夠提高對霉菌的鑒定能力[3,10-14]。本研究通過收集臨床菌株進行了自建本地化霉菌數據庫的研究。

首先，自建霉菌數據庫大大豐富了原商品化數據庫的霉菌種類和數量。本研究自建數據庫共包含19個菌屬，67個菌種，204株霉菌質譜圖，與商品化數據庫比較，自建數據庫新增了10個菌屬，42個菌種，204株霉菌的質譜圖。自建數據庫與商品化數據庫合并后形成的擴展數據庫共包括53個菌屬，169個菌種，569株霉菌的質譜圖，不僅豐富了商品化數據庫菌株的數量和種類，商品化數據庫部分菌株來源于環境或工業標準菌株，而自建數據庫中的菌株均來源于臨床標本，能夠更加貼近臨床菌株的鑒定需求。如曲霉菌是臨床感染常見的霉菌種類，本研究中新增曲霉菌69株，其中7種為商品化數據庫中未包含的菌種。

其次，通過對數據庫鑒定能力的驗證可評價自建數據庫用于臨床常見霉菌鑒定的準確性。隨機選取56株臨床來源霉菌，分別用自建數據庫、商品化數據庫和擴展數據庫進行菌種鑒定，與18S rDNA擴增測序的鑒定結果進行比較，計算各數據庫的鑒定正確率。通過數據分析，商品化數據庫鑒定的正確率僅為32.1%，而且從鑒定分值來看，>2.0分的只有2株，<1.7分的有6株，雖然這6株霉菌鑒定結果正確，但在實際工作中按照判斷標準，<1.7分的鑒定結果是不可信的，因此，應用商品化數據庫進行56株霉菌的鑒定，只有12株霉菌得到可信的正確鑒定結果。自建數據庫的鑒定正確率達到87.5%，46株霉菌得到可信的正確鑒定結果。擴展數據庫的鑒定正確率高達91.1%，48株霉菌得到可信的正確鑒定結果。對商品化數據庫和擴展數據庫鑒定正確率進行χ2檢驗，差異有統計學意義(χ2=58.35，P<0.05)，說明加入了自建數據庫的霉菌質譜圖后，明顯提高了MALDI-TOF MS對臨床常見霉菌的菌種鑒定能力。

本研究發現，霉菌鑒定即便在一定程度上通過自建數據庫提高了其鑒定能力，與細菌鑒定比較，仍存在一定的局限性，主要是因為霉菌的菌絲及分生孢子等特殊結構的細胞壁較厚，常規的前處理方法難以重復裂解細胞壁，釋放菌體蛋白，導致鑒定分值較低，如臨床常見的雜色曲霉，盡管商品化數據庫中存在10株雜色曲霉的質譜圖，本研究中的4株雜色曲霉有1株鑒定錯誤，其余3株的鑒定分值<1.7分。另有研究報道，霉菌的培養條件與MALDI-TOF MS鑒定能力也存在一定相關性，28 ℃培養溫度下的鑒定率高于35 ℃培養溫度，培養第2、3天種水平和屬水平鑒定率均較高，但沙保羅和土豆葡萄糖瓊脂兩種培養基間的鑒定率差異無統計學意義(P>0.05)[15]。所以，通過建立基于臨床來源菌株的霉菌數據庫，摸索適宜的菌株前處理方法，有助于充分發揮MALDI-TOF MS鑒定高通量、速度快、操作簡便等優勢，提高臨床各類感染來源霉菌的鑒定能力。

綜上所述，本研究通過收集臨床菌株建立本地化的MALDI-TOF MS霉菌數據庫，大大豐富了商品化數據庫菌株的種類和數量，經驗證，擴展數據庫明顯提高了臨床菌株的鑒定能力。在今后的臨床工作中，應不斷添加新菌種，優化菌株前處理條件，為臨床侵襲性感染霉菌的快速準確鑒定提供有力支持。