m6A去甲基化酶ALKBH5與弱精癥的相關性研究*

夏 維，胡 玲，劉 東，劉 琴，胡紅兵△

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院/武漢市婦幼保健院 1.血液腫瘤科；2.急診科；3.手術室；4.輸血科，湖北武漢 430015

不孕不育影響著全世界大約15%的育齡期夫婦，超過50%的不孕病例是由男性不育造成。男性不育與諸多因素有關，如遺傳因素、環境因素、生殖道感染、精索靜脈曲張等[1-2]。精子活力降低，也被稱為弱精癥，是一種常見的導致不孕的原因，約占男性不育癥病例的18%[3]。目前，臨床實驗室的精液檢測報告仍以精子數量、形態、動力學內容為主，遠遠不能滿足臨床診斷和治療的需求，更不可能為預防不孕不育提供指導。

RNA修飾是生物體內普遍存在的一種現象，極大地影響著RNA的生理功能。N6-甲基腺嘌呤(m6A)是mRNA上最為常見的修飾[4]。與DNA中胞嘧啶甲基化(5mC)的去甲基化類似，兩種m6A的去甲基化酶FTO和ALKBH5相繼被發現，表明m6A修飾是動態的，且在調控基因表達中起重要作用[5-6]。在對ALKBH5催化m6A去甲基化的研究中，ZHENG等[7]發現ALKBH5的去甲基化作用與小鼠的生殖能力相關。由此，本研究通過檢測弱精癥患者m6A水平和ALKBH5的相對表達水平，探究m6A和ALKBH5對男性不育的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集武漢兒童醫院15例弱精癥患者(弱精癥組)和15例健康者(對照組)的30份精液標本，所有標本均為禁欲2～7 d，手淫方式獲得。新鮮精液標本在37 ℃液化30 min后進一步處理。分組標準：前向運動精子數(PR)+非前向運動精子數(NP)<40%為弱精癥組，PR+NP≥40%或者PR≥32%為對照組。弱精癥組年齡(32.67±4.59)歲，對照組年齡(32.33±6.00)歲，兩組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。筆者利用以往臨床診療中獲得的病歷或生物標本進行實驗室研究，經武漢兒童醫院倫理委員會批準，并免除受試者知情同意。

1.2儀器與試劑 Percoll分離液(美國Pharmacia公司)，逆轉錄試劑盒(FSQ-301，日本TOYOBO公司)，TRIzol(美國Invitrogen)，2×iTaq SYBR GREEN Supermixes(美國Bio-Rad公司)，標準品(rA、rU、rC、rG、dA、T、dC、dG，中國西格瑪奧爾德里奇公司)，標準品(m6A，中國漢虹化工公司)，S1核酸酶(中國寶生生物公司)，堿性磷酸酶(中國寶生生物公司)、磷酸二酯酶(中國西格瑪奧爾德里奇公司)，氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)，無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；NanoDrop(ND2000)超微量分光光度計(美國Thermo公司)，實時熒光定量PCR儀(qPCR美國Bio-Rad公司)，低溫離心機(美國Beckman公司)，LC-20AD高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，AB 3200 QTRAP質譜儀(美國Life Technologie公司)，Hisep C18-T色譜柱(150.0 mm×2.1 mm×5.0 μm，中國韋泰公司)。

1.3精子的純化 參照第五版世界衛生組織(WHO)人類精液處理與實驗室手冊[8]，采用密度梯度法純化精子。取2 mL精液加入6 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，顛倒混勻數次后4 ℃ 300×g離心15 min，棄上清液，1 mL PBS重懸精子沉淀，緩慢加入密度梯度液[下層為1 mL 80%(v/v)Percoll分離液、上層為1 mL 40%(v/v)Percoll分離液]上方，避免打破密度梯度液的分層界面，4 ℃ 400×g離心20 min，棄上清液，2 mL PBS重懸沉淀，取1滴精子重懸液滴于載玻片上，顯微鏡400倍視野下觀察，比較純化前后精子中的上皮細胞的數量，確認精子的純度。

1.4RNA提取 將2 mL精子重懸液，400×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL TRIzol，0.2 mL氯仿，大力搖管15 s，室溫孵育2～3 min，4 ℃，12 000×g離心15 min。將上層水相轉移到一個新管，1∶1加入異丙醇，室溫孵育2～3 min，4 ℃，12 000×g離心10 min。棄上清液，加入1 mL 75%的乙醇洗滌RNA沉淀，渦旋混合。4 ℃，7 500×g離心5 min。40 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀，用NanoDrop檢測RNA的濃度與純度。

1.5LC-MS/MS檢測m6A水平 利用核酸酶S1、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶酶解精子RNA。液相色譜與質譜聯用系統,檢測方式為多反應監測(MRM)模式，監測離子對(母離子→子離子)分別為：m6A(282.2→150.1)、rA(268.4→136.2)、rU(245.4→113.1)、rC(244.4→112.2)、rG(284.5→152.2)、dA(252.4→136.2)、T(243.3→127.2)、dC(228.4→112.2)、dG(268.4→152.4)。

1.6qPCR法檢測ALKBH5相對表達水平 反轉錄試劑盒將精子RNA反轉錄為cDNA,qPCR儀檢測ALKBH5的相對表達水平，利用內參基因β-ACTIN和GAPDH標化，引物如下(5′→3′):ALKBH5上游引物5′-AGGGGAAGCGTGACTGTGC-3′，下游引物5′-GGGTGCATCTAATCTTGTCTTCC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTATAAATTGAGCCCGCAGC-3′，下游引物5′-CCAATACGACCAAATCCGTTG-3′；β-ACTIN上游引物5′-CCAGCTCCTCCCTGGAGA-AG-3′，下游引物5′-ACAGGACTCCATGCCCAG-G-3′。

2 結 果

2.1兩組精液常規參數比較 弱精癥組的精子濃度、PR、NP和正常形態精子數均明顯低于對照組，不動精子數(IM)和精子畸形指數(SDI)明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組間精子pH值和畸形精子指數(TZI)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組精液常規參數比較

續表1 兩組精液常規參數比較

2.2兩組m6A水平比較 弱精癥組精子m6A水平為0.21±0.02,明顯高于對照組的(0.14±0.01)，差異有統計學意義(P=0.005)。

2.3兩組ALKBH5相對表達水平比較 弱精癥組精子ALKBH5的相對表達水平為0.76±0.08,低于對照組的(1.00±0.08)，差異有統計學意義(P=0.047)。

2.4ALKBH5、m6A與精子活動度相關性分析 ALKBH5與PR和NP呈正相關(r=0.512、0.377，P<0.05)，與IM呈負相關性(r=-0.497,P<0.05)，與pH值、精子濃度、正常形態精子數、TZI、SDI無相關性(P>0.05)。見圖1。此外，m6A與RP和NP呈負相關(r=-0.422、-0.425，P<0.05)，與IM呈正相關(r=0.528,P<0.05)，與pH值、精子濃度、正常形態精子數、TZI、SDI無相關性(P>0.05)。見圖2。

注:A為ALKBH5與PR的相關性散點圖；B為ALKBH5與NP的相關性散點圖；C為ALKBH5與IM的相關性散點圖。

注:A為m6A與PR的相關性散點圖；B為m6A與NP的相關性散點圖；C為m6A與IM的相關性散點圖。

3 討 論

弱精癥是男性不育的重要表征之一，精子活動度降低是弱精癥的主要臨床表現[9]。本研究通過檢測弱精癥患者m6A水平和去甲基化酶ALKBH5的相對表達水平，發現弱精癥患者較健康者ALKBH5相對表達水平降低，m6A水平升高。ALKBH5是已知的m6A去甲基化酶[10]，因此，筆者認為弱精癥患者m6A水平升高的原因可能是由去甲基化酶ALKBH5相對表達水平降低引起的。

m6A與生殖的相關研究可以追溯至1997年，BOKAR等[11]首次證實，m6A甲基轉移酶METTL3(MT-A70)的mRNA表達在睪丸中最高。此后又有研究證實，m6A甲基轉移酶在配子的生成、胚胎的形成和干細胞的自我更新等過程中均發揮重要作用[12]。METTL3與配子生成和發育相關，在酵母[13]、果蠅[14]、植物[15]中敲除METTL3的同系物，會出現配子生成障礙。此外，ALKBH5的去甲基化作用與小鼠的生殖能力相關。小鼠所有器官中，精巢中的Alkbh5基因的表達最高，并且Alkbh5基因的缺失會導致小鼠精巢萎縮，精子數目減少，形態異常，運動性降低[7]。這些結果表明ALKBH5可能通過使mRNA中m6A去甲基化調控精子的生成和功能。本研究結果顯示，ALKBH5的相對表達水平與精子活動度指標(RP、NP、IM)具有相關性，且m6A也與這些指標相關，進一步證實ALKBH5可能通過使m6A去甲基化與精子活動功能具有相關性。成熟的精子核中含有多種RNA[16],其中精子mRNA的表達與精子活動度及男性生殖密切相關。由此筆者猜想精子RNA的m6A 水平改變可能會影響與精子活動度相關基因的mRNA穩定表達，但到底是哪些基因受到影響仍有待于進一步研究。

綜上所述，在弱精癥患者中，m6A及其去甲基化酶ALKBH5與弱精癥具有相關性，檢測男性不育患者精液的ALKBH5相對表達水平，對臨床診斷治療可能具有一定的指導意義。