3種檢測方法在兒童活動性結核病診斷中的應用*

楊 碩，李貴霞，李文輝，郭映輝，黃 慧，張文超，王 樂△

河北醫(yī)科大學附屬河北省兒童醫(yī)院：1.兒科研究所；2.檢驗科；3.感染科，河北石家莊 050031

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年7月至2019年3月于本院就診的疑似結核病患兒病例資料并篩選。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準。活動性結核病組(結核病組)納入標準：細菌學確診患兒體液標本抗酸染色陽性或血液結核菌培養(yǎng)陽性；臨床診斷的活動性結核病患兒存在疑似活動性結核病癥狀，影像學檢查提示存在活動性結核病，抗結核治療有效[7]。非結核病組為經(jīng)臨床診斷排除結核感染的其他疾病患兒。排除標準：(1)入院前已接受抗結核治療；(2)使用免疫抑制劑或糖皮質激素治療>1周[8]；(3)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染；(4)未同時采用IGRA、TST兩種方法檢測；(5)臨床信息不全或診斷不明確。符合以上任一項即可排除。

最終納入患兒367例，年齡0～15歲，結核病組113例，非結核病組254例。結核病組中，男73例，女40例；年齡1個月至<16歲，0～<2歲15例，2～<6歲37例，6～<10歲32例，10～15歲29例；肺結核100例(88.5%)，肺結核合并肺外結核5例(4.4%)，肺外結核8例(7.1%)。非結核病組中，男159例，女95例；年齡1個月至<16歲，0～<2歲57例，2～<6歲85例，6～<10歲67例，10～15歲45例。

1.2檢測方法

1.2.1IGRA 入院或就診當天以肝素抗凝管采集患兒靜脈外周血2～4 mL，室溫6 h內分離單個核細胞，采用英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的結核感染T細胞免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)試劑盒檢測，具體操作參照試劑盒說明書。結果判斷：當陰性對照孔斑點數(shù)為0～5時，CFP-10和ESAT-6抗原檢測孔任一孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6判為陽性；當陰性對照孔斑點數(shù)為≥6時，檢測孔計數(shù)>2倍陰性孔斑點數(shù)方可判斷為陽性；陽性對照孔斑點數(shù)≥20，檢測孔計數(shù)均達不到陽性標準時則判斷為陰性。

1.2.2TST 入院或就診當天于患兒前臂1/3皮膚無瘢痕部位皮下注射0.1 mL結核菌素純蛋白衍化物(5 IU)，48～72 h后觀察反應情況并測量硬結平均直徑(mm)。結果判斷：硬結平均直徑<5 mm或無反應為陰性(-)；5～<10 mm為陽性(+)；10～<20 mm為中度陽性(++)；≥20 mm為強陽性(+++)；除硬結外有水皰、破潰及雙圈反應為極強陽性(++++)。

1.2.3TB-Ab檢測 入院或就診當天以分離膠促凝管采集患兒靜脈外周血2 mL，48 h內分離血清，使用南京大淵生物技術工程有限公司生產(chǎn)的結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片法)及PBT-X4型生物芯片識別儀檢測，具體操作參照試劑盒說明書。結果判斷：脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、結核菌重組蛋白抗原16×103和38×103IgG抗體，若其中任何一種抗體為陽性，則判斷該標本結核分枝桿菌抗體陽性；若3種抗體檢測均為陰性，則結果判定為陰性。

1.3評價指標 臨床最終診斷為“金標準”，分析參數(shù)包括靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、約登指數(shù)、一致性及受試者工作特征曲線下面積(AUC)等。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，采用McNemar檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。一致性采用一致性檢驗，以Kappa值表示，Kappa>0.75表示一致性高；Kappa=0.40～0.75表示一致性中等；Kappa<0.40表示一致性差。

2 結 果

2.13種檢測方法的參數(shù)分析 3種方法中IGRA靈敏度(90.1%)最高，TB-Ab檢測最低(7.9%)；TB-Ab檢測特異度(98.6%)最高，TST最低(83.5%)。IGRA的陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、約登指數(shù)和AUC均高于TST及TB-Ab檢測；IGRA的陰性似然比均低于TST和TB-Ab檢測。

植物園中的盆栽桂花、銀邊翠、時令蔬菜，質量分數(shù)為4.2%的碳酸氫鈉溶液、質量分數(shù)為25%的氫氧化鈉溶液、質量分數(shù)為0.1%的碘液。

IGRA與臨床診斷結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，TST和TB-Ab檢測與臨床診斷結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IGRA在三者中具有較高的臨床診斷一致性(Kappa=0.800)。見表1。

2.2IGRA與TST在各年齡組的參數(shù)分析 IGRA在4個年齡組患兒中，6～<10歲組靈敏度(96.9%)最高，0～<2歲組特異度(96.5%)最高。與臨床診斷比較，2～<6歲組一致性最高；6～<10歲組一致性中等，與臨床診斷結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

TST在4個年齡組患兒中，6～<10歲組靈敏度(90.6%)最高，10～15歲組特異度(86.7%)最高。與臨床診斷結果比較，4個組一致性中等；0～<2歲組TST結果與臨床診斷結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

在4個年齡組患兒中，0～<2歲組IGRA的靈敏度與TST相等，其他年齡組IGRA靈敏度均高于TST；6～<10歲組IGRA特異度及陽性預測值均低于TST，其他3組IGRA特異度及陽性預測值均高于TST。IGRA在各年齡組的陽性似然比、陰性預測值、約登指數(shù)、AUC和Kappa值均高于TST，陰性似然比均低于TST，見表2。

表1 3種檢測方法的參數(shù)分析

表2 各年齡組IGRA和TST的參數(shù)分析

2.3聯(lián)合檢測 當IGRA與TST聯(lián)合檢測時，結核病組中共有109份標本結果為陽性，聯(lián)合檢測的靈敏度為96.46%。

3 討 論

2018年，全球接受結核病預防性治療的5歲以下患兒占估計符合納入治療條件的130萬例的27%[1]，加強兒童結核病和潛伏結核感染(LTBI)診斷是控制結核病傳播的重要手段。細菌學檢查是結核病診斷的“金標準”，但患兒的涂片陽性率一般為0%～15%，培養(yǎng)陽性率低于30%～40%，這與患兒排菌量低且標本留取困難、結核菌培養(yǎng)條件苛刻等因素有關[9-10]。因此，傳統(tǒng)的病原菌檢測方法并非兒童結核病診斷的首選。本研究針對結核病患兒評價3種常用免疫學方法的診斷價值，并評估不同年齡階段患兒中IGRA與TST的應用價值。TB-Ab檢測在本研究第一階段中與臨床診斷結果一致性低，故不在亞組中進一步分析。

T-SPOT.TB是通過檢測結核特異的效應T細胞所分泌的γ-干擾素來判斷受試者是否存在結核菌感染。機體感染結核菌后，可形成結核特異性記憶型T細胞在體內長期存在，當免疫細胞再次受到抗原刺激時，記憶T細胞迅速活化增殖釋放γ-干擾素。試劑采用兩種結核特異抗原(ESAT-6、CFP 10)，其與卡介苗(BCG)和多數(shù)非結核分枝桿菌(NTM)不發(fā)生交叉反應[11]，所以特異度高，適合用于BCG接種率較高的地區(qū)[12]。此外，由于可同時檢測CD4+及CD8+T細胞，所以其靈敏度受免疫力情況影響小。PLANA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，即使在患有血液病的免疫抑制結核病患者中，IGRA可達到44.2%的陽性率，明顯高于TST(17.4%)。本研究結果顯示，IGRA結果與臨床診斷結果一致性高，提示該方法對診斷兒童活動性結核病的應用價值較高，與孫琳等[5]和鮑磊等[14]研究結果一致。LTBI是人體受到結核分枝桿菌刺激后出現(xiàn)持續(xù)免疫反應但沒有活動性結核病臨床證據(jù)的一種狀態(tài)，其隱匿性強，早期難被發(fā)現(xiàn)。AHMED等[15]認為，LTBI兒童1年內約有15%～43%可發(fā)展為結核病，IGRA對于<15歲LTBI患兒具有較高的特異度和陽性預測值。因此，臨床診療時對于此類IGRA檢測陽性而無臨床癥狀病例應當高度重視，評估是否為LTBI患兒，并進行及早干預。

TST是臨床常用的檢測結核菌感染的技術手段之一，利用結核菌素蛋白衍生物可刺激機體產(chǎn)生免疫反應。TST陽性結果不能排除BCG接種反應與NTM感染，而陰性結果亦不能排除結核病的可能[7]。我國新生兒BCG接種率較高，在一定程度上影響了試驗的準確度。本研究中TST靈敏度77.9%，特異度83.5%，與臨床診斷結果比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。臨床應用中常通過提高TST的陽性標準以提高其特異度，但相應會使其靈敏度降低，增加了漏診的可能性。國家結核病規(guī)劃指南推薦對免疫抑制兒童或5歲以下的結核病密切接觸兒童以TST結果>5 mm作為陽性診斷標準，其他兒童以>10 mm作為陽性診斷標準，以此來提高試驗的準確性[16]。

TB-Ab檢測的結核蛋白芯片技術是利用微陣列技術將純化的結核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16×103及蛋白38×1033種抗原固相于同一微孔濾膜上，與血清中抗體進行快速凝集反應，并利用免疫金作為標記物直接在膜上顯色。而結核分枝桿菌為胞內寄生菌，機體的抗結核免疫主要依賴于特異性的細胞免疫。本研究結果顯示，TB-Ab檢測的AUC僅為0.533，遠遠低于成人的數(shù)據(jù)[17],不能滿足臨床診斷需要。分析認為兒童免疫系統(tǒng)尚不成熟，血清中未產(chǎn)生足夠抗體，從而直接影響了檢測結果。有研究認為血清結核抗體反應差異較大可能還與地理環(huán)境、結核菌基因型及抗原特異性等多種因素相關[18-19]，因此該方法診斷價值還需進一步研究驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGRA在6～<10歲組中特異度較低，分析認為可能是由于IGRA陽性結果不能排除LTBI，而目前對診斷LTBI沒有明確的“金標準”，臨床診斷不能準確鑒別患兒是否為LTBI而造成的。有Meta分析結果發(fā)現(xiàn)，IGRA對結核病患兒檢測的靈敏度可高于臨床診斷結果[20]。TST在0～<2歲組中特異度低，分析認為低齡兒童BCG接種時間間隔短，機體記憶性保護作用仍較強，對TST產(chǎn)生了較多的交叉反應，從而影響試驗結果。既往研究發(fā)現(xiàn)，BCG保護作用可持續(xù)10年左右，且隨著年齡增長其保護作用逐漸減弱[21-22]，這與本研究中10～15歲組TST的靈敏度下降而特異度升高的結果相符。

IGRA結果在4個年齡組中約登指數(shù)及Kappa值均高于TST，表明其在各年齡組的診斷價值均優(yōu)于TST。而0～<2歲組和2～<6歲組中IGRA結果與臨床診斷結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯示其在低年齡段組患兒中也具有良好的應用價值。

由于結核病患兒細菌學檢查結果陽性率低，本研究主要以臨床診斷為“金標準”評估3種檢測方法的診斷價值，且不能排除LTBI的情況，研究結果可能存在一定的偏倚，因此采用較嚴格的入組篩選標準。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，相比TST與TB-Ab檢測，IGRA可以更有效地輔助臨床對兒童結核病進行早期診斷，具有較高的應用價值。而TST因操作簡便快速，作為臨床廣泛應用的篩查手段仍具有重要的檢測價值。聯(lián)合使用IGRA及TST可以更好地提高各年齡段兒童結核病的診斷靈敏度，有助于對結核病患兒的及早發(fā)現(xiàn)，及早干預，減少其嚴重并發(fā)癥及后遺癥發(fā)生。