重組慢病毒介導STAT3過表達質粒轉染促進顯性脊柱裂胎鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞分化

姜明宇，任明永，高 瑩，吳 楠，于忠瑩

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院兒科，黑龍江 哈爾濱 150001)

先天性脊柱裂的發病與機體的細胞過度凋亡存在著密切的關系[1]。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)移植可以修復先天性脊柱裂多種組織發育異常，不僅可以修復各種神經元發育異常，而且也可以修復骨質發育異常。最新研究表明，在移植后的脊髓組織中發現大量存活的干細胞，并可轉化為星形膠質細胞和神經元，彌補神經功能的巨大缺失[2]。STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)在神經胚胎發育過程中，細胞凋亡和細胞信號傳導的調節以及干細胞的分化和轉化過程中均發揮不可估量的作用。此外，STAT3在神經系統發育過程中的多個生理階段，神經細胞的存活和損傷后修復的調節均有重要作用[3]。慢病毒為一種逆轉錄病毒，因其具有感染率高、可感染不分裂的細胞，整合表達穩定、對神經元具有高度親嗜性等優勢，可作為神經系統非常理想的載體[4]。本課題設計利用慢病毒-STAT3質粒標記骨髓間充質干細胞對顯性脊柱裂大鼠在第16天進行胚胎期移植，觀察STAT3過表達質粒轉染對干細胞移植過程中神經分化的效果影響。為更好地服務于臨床產前診斷，早期治療小兒顯性脊柱裂畸形奠定堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1顯性脊椎裂畸形胎鼠模型的構建:將孕Wistar大鼠在受孕第10天(E10)給予4%維甲酸一次性胃管注射(135mg/kg)，從而誘導顯性脊柱裂動物模型。

1.2慢病毒STAT3過表達載體的構建:慢病毒STAT3過表達載體購自廣州源井生物科技有限公司，選取pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro片段作為質粒的克隆載體。克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為U06922。合成后經基因測序驗證，進一步證實序列準確性。

1.3慢病毒細胞轉染和實驗分組:取生后10d Wistar大鼠股骨骨髓組織，在無菌條件下提取BMSCs，采用全骨髓貼壁法分離和純化BMSCs。本研究采取第3代BMSCs，在6孔板中接種上述細胞，待融合率達到50%時開始慢病毒轉染，慢病毒滴度維持在3×107(MOI=50)，利用慢病毒作為載體將STAT3過表達質粒轉染到BMSCs上 (MOI值300～500)。根據病毒轉染情況分為如下三組：空白對照組，未轉染慢病毒的BMSCs；陰性對照組，轉染無序列質粒載體慢病毒的BMSCs；實驗組，轉染STAT3過表達載體慢病毒的BMSCs。

1.4骨髓間充質干細胞的鑒定:通過流式細胞檢測法對CD34，CD45，CD73和CD90表面蛋白進行測定，為BMSCs的提取和鑒定提供科學依據。

1.5通過CCK-8試劑盒測定細胞活性:首先完善干細胞計數，在96孔4板中接種細胞，每孔細胞量維持不低于5×104個，同時設置2個復孔，37℃細胞培養箱中進一步孵育，選取在6，12，24，48和72h每孔加入10μL CCK-8溶液，檢測波長在450nm時OD值。

1.6骨髓間充質干細胞移植治療:在孕鼠第16天(E16)時，經10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后，三次腹壁清理及消毒后，依次經過腹壁，宮壁和羊膜囊，暴露胎鼠，計數宮內存活胎鼠數量及部位，在顯微鏡下分離胎鼠腰骶部。明確有無畸形后，經微量注射器迅速注射0.2μL未轉染慢病毒的BMSCs(空白對照組)、轉染無序列質粒載體慢病毒的BMSCs(陰性對照組)、轉染STAT3過表達載體慢病毒的BMSCs(實驗組)。迅速縫合宮壁、關閉腹腔，待孕鼠麻醉恢復正常后放回籠中繼續觀察。待飼養至20d時，根據分組，取出胎鼠脊髓組織。

1.7實時熒光定量PCR檢測:加入RNA裂解液1mL，用無菌剪刀剪碎研磨，再次加入1mLRNA裂解液，注射器吹打成勻漿狀。加入200μL氯仿充分混勻，13000rpm 4℃下離心15min。小心吸取上清，加入500μL異丙醇。4℃放置30min，13000rpm 4℃下離心15min。棄上清，沉淀物加入1000μL 70%酒精，漂洗一次。再次離心，吸取上清，沉淀物加入DEPC水20μL后制備成RNA樣本并檢測濃度和純度。按照逆轉錄試劑反應說明書，配制反應體系。反應條件為：①95℃，0.5min，1個循環；②95℃，5sec；60℃，34sec，40個循環；③95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec，1個循環。統計擴增結果并進行統計分析。Real Time-PCR Master Mix中的SYBR Green染料的熒光信號的強弱強度與雙鏈DNA的數量相關，根據熒光信號的強弱檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。在60℃設置熒光檢測點，以GAPDH作為內參照，結果以相對數值，即2-△△Ct表示。

1.8Western-blot檢測:按照分組分別100mg脊髓組織加入1.5mLRIPA裂解液，組織勻漿機打碎組織，重復三次，均在冰上操作，每次約10sec。吸取上清液至EP管中，將EP管置于冰上裂解30min。然后將EP管于4℃下12000rpm離心15min，吸取上清至EP管中，即為提取的脊髓組織總蛋白。經過制膠、蛋白上樣液、SDS-PAGE、封閉、洗膜、一抗和二抗孵育。將ECL試劑盒中的A、B試劑等體積混合后暗室曝光進行發光顯影，Western Blot成像系統進行圖像的采集。應用Image-J軟件對條帶進行掃描及灰度值分析。

2 結 果

2.1Wistar大鼠移植前骨髓間充質干細胞流式細胞鑒定結果:通過流式細胞技術檢測4種表面標記物。結果表明：CD73和CD90表面標記物陽性，CD34和CD45標記物陰性(見圖1)。其中，CD73和CD90為骨髓間充質干細胞表面纖維蛋白和核糖體受體，為非造血細胞起源。而CD34和CD45是內皮細胞和造血細胞的表面受體，提示Wistar大鼠骨髓間充質干細胞分離成功。

圖1 流式細胞結果提示骨髓間充質干細胞分離成功

2.2CCK-8檢測移植前各組細胞增殖活性:以4，8，12，16，20，24，48和72h為時間節點，檢測空白對照組，陰性對照組和實驗組移植前骨髓間充質干細胞的增殖活性。結果提示：三組活細胞量在時間節點無統計學差異(P>0.05)。提示慢病毒轉染對骨髓間充質干細胞的增殖活性無顯著影響，見圖2。

圖2 CCK-8細胞增殖曲線(移植前)

2.3CCK-8檢測移植后各組細胞增殖活性:在移植后的第4天(E20)取出胎鼠脊髓，以4，8，12，16，20和24h為時間節點，對空白對照組，陰性對照組和實驗組分別檢測骨髓間充質干細胞的增殖活性，測定各組活細胞的OD值。結果提示：實驗組在移植后的第8小時OD值最高，之后逐漸下降，與空白對照組和陰性對照組相比有統計學差異(P<0.05)。而空白對照組和陰性對照組檢測后OD值高峰時間和峰值均無統計學差異，如圖3所示。

圖3 CCK-8細胞增殖曲線(移植后)

2.4移植后利用實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測各組脊髓組織中STAT3和pSTAT3的表達:經RT-PCR檢測，與空白對照組和陰性對照組相比，在實驗組中pSTAT3 mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05),而STAT3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。Western-blot法STAT3和pSTAT3相對蛋白表達趨勢與實時熒光定量PCR結果一致，見表2和圖4。

圖4 Western-blot法檢測各組脊髓組織中STAT3和pSTAT3的表達情況

表1 空白對照組陰性對照組和實驗組STAT3 pSTAT3 mRNA表達水平比較

表2 空白對照組陰性對照組和和實驗組STAT3 pSTAT3 蛋白表達水平比較

2.5實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中神經標志物GFAP，NSE，NF和Nestin的表達:見表3，空白對照組、陰性對照組和實驗組三組GFAPmRNA相對表達量具有統計學差異。其中，在實驗組中GFAP mRNA相對表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。同時，NSE，NF和Nestin mRNA在各組中的相對表達趨勢與GFAP基本一致。另外，GFAP，NSE，NF和Nestin蛋白表達趨勢與實時熒光定量PCR結果完全相同，見表4和圖5。

表3 空白對照組陰性對照組和實驗組GFAP NSE NF和Nestin mRNA表達水平比較

表4 空白對照組陰性對照組和實驗組GFAP NSE NF和Nestin 蛋白表達水平比較

圖5 Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中神經標志物GFAP，NSE，NF和Nestin的表達情況

2.6實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中凋亡信號分子Caspase-8和Bcl-2的表達量:從表5 RT-PCR的結果中，我們可以發現：Caspase-8和Bcl-2在實驗組的相對表達水平要顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。經Western-blot法進一步驗證，結論與RT-PCR一致，見表6和圖6。

表5 空白對照組陰性對照組和實驗組Caspase-8 Bcl-2 mRNA表達水平比較

表6 空白對照組陰性對照組和實驗組Caspase-8 Bcl-2蛋白表達水平比較

圖6 Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中凋亡信號分子Caspase-8和Bcl-2的表達量

3 討 論

信號傳導與轉錄激活子-3(STAT3)來源于白介素-6(IL-6)作用于效應細胞后產生的急性期反應因子。多項研究表明STAT3可被眾多細胞因子激活，如被活化的JAKs、IL-4和IL-12等[5]。在細胞內，STAT3呈無活性非磷酸化單體形式，一旦被細胞因子等特異性刺激后，即發生磷酸化，繼而發生同源或異源二聚化轉變，隨后進入細胞核，與特異核酸序列結合，啟動下游各種靶基因表達。我們在研究中嘗試采用過表達技術，構建STAT3過表達質粒，結合慢病毒的高轉染效率，穩固轉染BMSCs，觀察到經CCK-8檢測，實驗組在移植后的第8小時OD值達到峰值，細胞增殖活性較空白對照組和陰性對照組顯著增強，提示STAT3過表達質粒轉染可明顯促進骨髓間充質干細胞和神經細胞之間轉化。同時，從RT-PCR和Western-blot二個層面，pSTAT3在實驗組中表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組，而實驗組中STAT3水平顯著降低，提示STAT3在移植治療過程中即發生磷酸化轉變，啟動下游各種靶基因的表達，促進BMSCs的轉分化和神經細胞的增殖分化。

本研究還發現：實驗組的GFAP mRNA相對表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組。NSE，NF和Nestin的mRNA各組相對表達量趨勢與GFAP相同。另外，GFAP，NSE，NF和Nestin相對蛋白表達量趨勢與實時熒光定量PCR結果完全相同。GFAP，NSE，NF和Nestin均來源于神經細胞表面的標識蛋白，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質細胞活化后的表面標志物[6]，維持細胞骨架的可塑性和張力強度；血清神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是一種特異性酸性蛋白酶，常見于多種神經內分泌細胞及神經元[7]；神經絲蛋白(Neurofilament，NF)作為神經細胞軸突中間絲的重要組分，可穩固神經纖維的彈性，使伸展發生正常并防止中斷。巢蛋白(Nestin)又被稱為第Ⅵ類中間纖維，研究表明是胰腺干細胞和神經干細胞的表面標志蛋白，是中間纖維家族的重要成員。本研究從基因和蛋白兩個水平，證實將慢病毒介導STAT3過表達質粒轉染BMSCs，可以有效提高其向神經細胞的轉化效率，使神經細胞的標記物(GFAP，NSE，NF和Nestin)相對表達量明顯增高。STAT3通過JAK/ STAT途徑與其他信號通路如MAPK途徑的對話，參與神經調節細胞因子(neuroregulatory cytokine)，白血病抑制因子(leukemia inhibtiory factor,LIF)，睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF) 等對神經前體細胞分化命運的調節，在此過程中STAT3抑制因子SOCS家族作為負反饋蛋白抑制JAK的活性。且STAT3在GFAP，NSE，NF和Nestin的啟動子上有相應的結合位點，在特定因子的誘導下大腦皮層前體細胞分化為形成膠質細胞，啟動GFAP，NSE，NF和Nestin基因的轉錄[8]。由此認為STAT3與神經細胞的分化密切相關。

神經管缺陷(neural tube defects，NTDs)是兒童相當常見的神經系統發育畸形，近年來逐漸增多，約占總出生人數0.1%-0.9%。神經溝中部或尾部閉合缺陷則引起脊柱裂[9]。最新研究表明，神經系統發育經歷一系列復雜的生物學過程，涉及神經細胞和神經元的增殖、分化、凋亡、自噬，神經突觸形成，信號傳遞和轉導以及神經網絡核團形成等。細胞凋亡作為生物細胞特殊形式的程序死亡，受周圍組織多種效應細胞的參與和調控，因此對生命活動的多個過程，如胚胎組織的早期發育、器官組織的形態發生以及效應器官的功能形成等均發揮巨大的調控作用。一旦細胞凋亡過度，則可引起體內相應神經細胞和脊髓組織受損，形成臨床上常見的脊柱裂畸形[10]。骨髓間充質干細胞具有自我更新和多向分化潛能等生物學特點,在特定的理化環境和細胞因子誘導下能夠轉化為多種細胞類型。最近研究表明，骨髓間充質干細胞可以分化為神經膠質細胞，神經元，肌細胞以及成骨、破骨細胞等[11]。因此，BMSCs是組織工程一種比較理想的種子細胞來源，干細胞移植治療先天性脊椎裂有望成為治療先天神經發育畸形最有前途的方法之一。本研究中，從基因蛋白兩個水平，移植后實驗組caspase-8和Bcl-2表達水平明顯低于空白對照組和陰性對照組，提示STAT3過表達質粒轉染BMSCs可以顯著抑制脊柱裂發病的凋亡進程，通過Caspase-8和Bcl-2兩個重要凋亡分子作用發揮抗凋亡效應。研究表明[12]：STAT3參與神經系統發育過程中神經細胞的分化，JAK/STAT信號轉導途徑是能夠決定細胞分化的一個重要機制，調控著相關基因的表達。在神經系統的發育過程中，STAT3與其他信號途徑協同調節體內神經前體細胞的分化命運，STAT3結合元件的甲基化狀態還決定了細胞的分化潛能。STAT3與神經干細胞的增殖密切相關，在成熟的神經細胞或膠質細胞中均高度表達，提示STAT3對神經上皮細胞早期的分化起重要調控作用。

綜上所述，構建STAT3過表達質粒通過慢病毒介導的方法轉染骨髓間充質干細胞，可以提高其向神經細胞轉化的效率，為先天性脊柱裂的治療提供新的種子細胞。