聚焦超聲聯合程序性死亡蛋白1單克隆抗體治療大鼠腦膠質瘤

李進丹，王 瑞，楊 軍，羅玥媛，郭效賓，廖承德

(云南省腫瘤醫院 昆明醫科大學第三附屬醫院放射科，云南 昆明 650118)

膠質瘤是中樞神經系統(central nervous system, CNS)最常見惡性腫瘤，惡性程度及致死率均高。大腦血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是臨床治療膠質瘤困難的主要原因。聚焦超聲(focused ultrasound, FUS)與超聲造影劑微泡(microbubbles, MB)相結合，可局部、無創地暫時開放BBB。近年來，以程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)單克隆抗體(簡稱單抗)為代表的免疫治療用于多種腫瘤展現出極大潛能。本研究通過動物實驗觀察FUS與PD-1單抗協同治療膠質瘤的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 50只6～8周齡雄性SD大鼠購于昆明醫科大學實驗動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]，體質量80～100 g。C6細胞株購自昆明動物所，培養后經胰酶消化制成細胞懸液(細胞濃度約2～5×105個/ml)。本研究經昆明醫科大學倫理委員會審核通過(批準號：kmmu2021006)。

1.2 測試FUS安全性及BBB開放 隨機選取10只大鼠測試FUS安全性及BBB開放情況，見圖1A。經尾靜脈注射MB(六氟化硫微泡，聲諾維?，上海博萊科信誼藥業)0.2 ml/100 g體質量，以低功率聚焦超聲實驗裝置(重慶融海超聲醫學工程研究中心有限公司，重慶)行FUS輻照，條件分別為4 W/200 s、4 W/150 s、4 W/250 s；之后經尾靜脈注射伊文藍(Evan blue, EB)0.2 ml/100 g體質量。

1.3 制作膠質瘤模型 將其余40只大鼠麻醉后俯臥保定于顱腦定位儀，暴露術區顱骨,于冠狀縫前1 mm、矢狀縫右3 mm，沿顱骨鉆孔注射5 μl C6細胞懸液制成膠質瘤模型。

1.4 MR檢查 采用Philips Ingenia 3.0T MR掃描儀，專用動物線圈(GC-MUC44-H300-AP，辰光醫療，上海)，于造模后第9天及第17天行頭部掃描，采集T2WI、對比動態增強MRI(dynamic contrast enhanced MRI, DCE-MRI)及增強T1WI。由2名具有5年頭部影像學診斷經驗的主治醫師觀察病灶MRI表現，測量病灶體積，意見不一致時經討論決定。采用數據處理軟件(Omni-Kinetics Version, V2.0.10，上海通用藥業公司)分析造模后第17天MRI，于增強T1WI腫瘤最大層面及對側放置3對約0.3 cm2ROI，測量其血流動力學參數，包括容積轉運常數(Ktrans)、速率常數(Kep)、血管外細胞外間隙容積分數(Ve)及血漿內容積分數(Vp)，取結果的平均值進行分析，計算相對Ktrans(rKtrans)、相對Kep(rKep)、相對Ve(rVe)及相對Vp(rVp)，相對參數值=損傷側參數值/對側參數值。

1.5 分組及干預 造模第9天MR檢查結束后隨機取8只模型鼠行病理檢查，以隨機數字法將其余32只大鼠均分為FUS組、PD-1單抗組、FUS+PD-1單抗聯合治療組(簡稱“聯合治療組”)及對照組，每組8只；于造模后第9天MR檢查后對前3組施加干預，隔天1次，共4次，對照組不予干預。FUS組：經尾靜脈注入MB 0.2 ml/100 g體質量后行FUS輻照，輸出頻率650 kHz±10%，輸出功率4 W，持續時間200 s。PD-1單抗組：將PD-1單抗(PD-1-IN-1, MedChemExpress公司)與生理鹽水混合稀釋成濃度1 mg/ml的PD-1溶液，緩慢注入腹腔1 mg/100 g體質量。聯合治療組：超聲輻照條件同前，輻照結束后經腹腔緩慢注入PD-1單抗溶液1 mg/100 g體質量。

1.6 病理檢查 注射EB后3～4 h予過量麻醉，以心臟灌注處死動物，取腦組織標本。對造模第9天MR檢查結束后隨機選取的8只動物腦組織標本行常規蘇木素-伊紅(HE)染色；對造模第17天4組大鼠腦組織行半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)及CD4、CD8免疫組織化學染色。由1名具有5年以上病理診斷經驗的主治醫師以盲法觀察切片，隨機選取8個不重疊高倍視野進行分析，以Image Pro軟件計算Caspase-3活化細胞百分比、CD4+和CD8+T細胞數量。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0及Graphpad prim 8統計分析軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FUS安全性及BBB開放情況 僅FUS輻照后腦組織見少量出血；功率4 W,輻照時間分別為150、200、250 s條件下，腦組織可見EB藍染而未見出血，見圖1。

圖1 測試FUS安全性及BBB開放情況 A.經尾靜脈注射MB后行FUS輻照； B.EB藍染結果(黑色虛線為切片位置，下排為上排切面圖)：僅以4 W/200 s條件對左側大腦半球行FUS輻照后可見腦組織少量出血(白箭)，4 W/200 s FUS輻照和MB條件下右側大腦半球BBB開放，腦組織見EB藍染(黑箭)； 4 W/150 s(左側大腦半球)和4 W/250 s(右側大腦半球)FUS輻照和MB條件下BBB開放，腦組織見EB藍染(黑箭)

圖2 造模第9天大鼠膠質瘤模型HE染色病理圖(右下圖示病理取材部位) A.正常腦組織(右上粉色區域)與腫瘤組織(左下藍色深染區域)交界處； B.腫瘤組織

表1 造模后第17天組間MRI血流動力學參數比較(±s)

表1 造模后第17天組間MRI血流動力學參數比較(±s)

組別rKtransrKeprVerVpFUS組105.32±20.18169.02±38.23600.16±69.1212.32±2.23PD-1單抗組54.31±6.03107.34±55.04539.33±59.8411.60±3.31聯合治療組102.61±15.03138.33±41.43521.12±53.306.53±2.15對照組34.70±9.95127.85±36.85519.48±50.869.23±4.58F值7.160.240.030.45P值0.010.770.210.53

2.2 各組膠質瘤生長情況 造模第9天腫瘤呈T1WI低信號、T2WI稍高信號，增強后明顯強化。HE染色片示大鼠腫瘤細胞分布密集，腫瘤細胞排列紊亂，可見較多異形細胞(圖2)。造模第17天，4組腫瘤體積較第9天不同程度增大,呈T1WI低信號、T2WI混雜信號，其內可見壞死區域，瘤周見片狀水腫信號，增強后病灶明顯強化(圖3)；腫瘤體積：對照組(62.12±3.32) mm2，PD-1單抗組(54.66±3.97) mm2，FUS組(46.27±7.95) mm2，聯合治療組(20.28±3.92) mm2，差異有統計學意義(F=13.27，P<0.01)；兩兩比較，聯合治療組腫瘤體積小于其余各組(P均<0.01)，對照組與PD-1單抗組(P=0.01)及對照組與FUS組(P<0.01)間腫瘤體積差異有統計學意義，而FUS組與PD-1單抗組腫瘤體積差異無統計學意義(P>0.50)。

2.3 組間MRI血流動力學參數比較 造模后第17天，4組間rKtrans值總體差異有統計學意義(F=7.16，P=0.01)，rVe、rKep、rVp差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。兩兩比較，FUS組與聯合治療組間rKtrans值差異無統計學意義(P=0.79)，其余各組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.4 病理 造模第17天4組間CD8+T細胞總體差異有統計學意義(F=389.90，P<0.01)；兩兩比較，聯合治療組CD8+T細胞較其余各組均增加(P均<0.05)，余各組差異均無統計學意義(P均>0.05)。4組間CD4+T細胞總體差異有統計學意義(F=254.10，P<0.01)；兩兩比較，聯合治療組CD4+T細胞較其余各組減少(P均<0.05)，余各組間差異均無統計學意義(P均>0.05)。4組間Caspase-3活化細胞百分比總體差異有統計學意義(F=21.73，P均<0.01)，兩兩比較，聯合治療組Caspase-3活化細胞百分比高于其余3組(P均<0.05),其余各組間差異均無統計學意義(P均>0.05)，見圖4、5。

圖3 造模第17天各組MRI顯示大鼠膠質瘤 A.對照組T2WI； B.FUS組增強T1WI； C.PD-1單抗組增強T1WI； D.聯合治療組增強T1WI

圖4 造模后第17天大鼠腦組織免疫組織化學染色結果柱狀圖 A.CD8+ T細胞數量； B.CD4+ T細胞數量； C.Caspase-3活化細胞百分比 *為組間比較P<0.05

圖5 造模后第17天大鼠腦膠質瘤病理圖(Caspase-3染色，×40) A.對照組； B.FUS組； C.PD-1單抗組； D.聯合治療組

3 討論

FUS開放BBB后，可將大分子藥物如抗體、納米顆粒和阿霉素脂質體甚至細胞因子和靶向免疫細胞制劑等向腦內遞送[1-3]。FUS聯合MB開放BBB可促進免疫調節劑向腦內輸送，改善腦腫瘤治療中的抗癌免疫反應[4-5]。分析其可能機制，首先，FUS產生的脈沖波與靜脈注射的MB發生穩定空化作用，使大腦血管內皮機械壓力增大，導致內皮間緊密連接打開，BBB開放，血管通透性增加，相對分子質量較大物質可進入大腦微環境[6]。DCE-MRI能監測BBB破壞后動力學改變[7-8]，Ktrans與BBB通透性高度相關，本研究中BBB開放后腦組織EB藍染，FUS輻照后腦腫瘤rKtrans明顯增高，與既往研究[9-10]結果相符。其次，腫瘤微環境中存在轉化生長因子β1、白細胞介素13、血管內皮生長因子等免疫抑制細胞因子，FUS誘導BBB開放可增強上述細胞因子的作用，通過非特異性免疫增強作用而減少特異性封閉分子/抗體向全身遞送，從而克服由腫瘤引起的免疫抑制作用[11]。CHEN等[11]以C6膠質瘤大鼠模型評估FUS誘導BBB開放的效能，發現FUS-BBB開放致白細胞介素12顯著增加，T細胞增殖活躍，促進干擾素γ產生，增強抗腫瘤細胞毒性免疫作用及相關抗癌免疫反應[12]。另外，人類主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)在腫瘤細胞往往表達較弱，呈遞抗原效率較差，免疫過程中不易監視和調控。FUS誘導BBB開放可增強腫瘤組織MHC表達，提高樹突狀細胞抗原呈遞效率。最后，PD-1為免疫抑制性受體，在活化T細胞、B細胞中廣泛表達，FUS可激活配體抗原呈遞細胞的滲透能力，增強免疫反應。FUS有助于改變腫瘤原有微環境，引發腫瘤細胞壞死或凋亡；而BBB開放有利于向大腦輸送免疫調節劑，促進抗癌免疫反應。本研究結果顯示，相比FUS組或PD-1單抗組，聯合治療組腫瘤生長明顯受抑制，體積縮小，提示應用FUS和MB開放BBB后以PD-1藥物治療膠質瘤效果更佳。

SATO等[13]發現上皮內CD8+T細胞高及CD8+/CD4+比值較高的上皮性卵巢癌患者預后較好，生存率較高，提示上皮內CD8+T細胞與上皮性卵巢癌預后相關，CD4+T細胞會影響CD8+T細胞的有益作用。張勇等[14]報道，CD4+/CD8+比值異常的鼻咽癌患者5年總生存率(67.95%)顯著低于CD4+/CD8+比值正常者(89.80%)，提示CD4+/CD8+比值低者預后較差。本研究以Caspase-3活化程度反映細胞凋亡程度，以CD4、CD8陽性表達細胞數量反映腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)浸潤程度，發現聯合治療組CD8+T細胞數量及Caspase-3活化細胞百分比均高于其余3組、CD4+T細胞數量低于其余3組，提示其抑制腫瘤生長效果較佳。FUS誘導BBB開放對機體全身T淋巴細胞種群無明顯影響，但觸發了TIL群體變化[11]。在微環境中，CD4+調節性T細胞和CD8+T細胞是膠質瘤TIL的重要組成部分。CD4+和CD8+T細胞均需激活才能破壞腫瘤細胞的有效免疫反應，CD4+T細胞參與調節CD8+T細胞免疫反應過程，且可能受免疫原性質、抗原提呈細胞激活狀態及效應和記憶CD8+T細胞所處微環境等影響[15]。CD8+T細胞浸潤有益于預后，CD4+T細胞有助于維持CD8+T細胞功能，但影響CD8+T細胞的有益作用，從而影響預后。腫瘤微環境復雜，CD4+和CD8+T細胞對膠質瘤的發展及預后存在一定影響，深入了解微環境免疫細胞作用機制對評價疾病預后極其重要。

綜上，FUS與抗PD-1單抗協同治療有利于延緩大鼠腦膠質瘤進展。