關于微生物檢測技術及其在食品安全中的應用研究

◎ 張思怡，聶曉臻，俞方璐

（中檢科（上海）測試技術有限公司，上海 201206）

近年來，在世界各國及各地區發生的微生物性食物中毒事件報告起數以及人數逐年增多，促使食品安全問題成為現代化發展中的重要社會問題。

因此為降低微生物性食品中毒事件，應當進一步強化安全意識，注重運用先進檢測技術控制食品質量，最大限度的防范微生物污染食品，保證人們的身心健康，促進食品市場穩定運行。

1 微生物檢測技術在食品安全檢測中的重要性

微生物檢測是食品安全保障中的重要環節，同時也是判斷食品是否具備食用價值的根本性指標依據。目前主要檢測對象包括蛋制品、奶制品、罐頭、淀粉制品以及食品調味品等。其大多是人們生活中經常食用或使用的食品及配料，一旦其存在微生物污染，則會對人體健康產生較大的不利影響[1]。因此在相關食品檢測中科學運用微生物檢測技術是至關重要的，其有助于檢驗食品微生物類型與數量，篩查出不符合質量安全標準的食品，對食品行業的健康、持續發展具有積極意義。

2 食品安全檢測中微生物檢測技術的操作步驟

2.1 樣本采集

采集罐頭食品樣本時，應使用無菌器械開展無菌操作。根據不同生產廠家、商標、品種、來源以及生產日期等進行分類。如按照生產班次進行檢測樣本采集，則需保障每個班次各品種的采樣基數需大于3罐。如按照殺菌鍋采樣，則每鍋可采集1罐，且每批每個品種應不少于3罐。當對成批罐頭實施微生物檢測時，發現有變形、膨脹、罐壁裂縫、破損等情況，可結合實際確定抽樣數量。為保障微生物檢測的有效性，需在采樣后3 h內進行檢驗。

2.2 樣本送檢

送檢食品微生物檢測樣本時，應當合理保存樣本的完整性，不得在送檢過程中出現變質、破碎等。送往實驗室后由相關送檢人員規范填寫單據，并交由專業檢測人員開展實驗檢驗活動。

2.3 樣本處理及檢驗

當樣本送到實驗室后，需對罐頭樣本進行一定的處理，從而便于開展檢驗檢測。即是針對新鮮的固體及液體罐頭樣本進行搗碎、均勻后開展檢驗。如對樣本實施冷凍，需及時進行解凍再采用對應的檢測技術。具體步驟則是取2管肉湯或溴甲酚紫葡萄糖肉湯、2管肝片肉湯或者剛經煮沸并迅速冷卻的皰肉培養基等。開展接種檢樣，通常情況下控制接種量在液體樣本的1～2 mL、固體樣本則在1～2 g即可。如固體與液體樣本同時存在，可各取一半。在實施接種后放置于37 ℃環境中，并進行需氧菌培養檢查以及厭氧菌培養檢查。在將檢樣涂片以及革蘭氏染色后實施鏡檢[2]。

2.4 結果報告

完成微生物檢驗后，如果所有需氧和厭氧培養基管內未發現細菌生長，則判斷無菌試驗合格，無需開展病原菌檢測，表明罐頭食品安全通過微生物檢測，無污染現象。如果需氧培養基存在有細菌生長現象，并在涂片中觀察到細菌，應針對檢樣開展進一步的致病性球菌檢驗和腸道致病菌檢驗。如果厭氧培養基中發現有細菌生長，涂片也存在細菌，則需對檢驗進行肉毒梭菌檢驗、魏氏梭菌檢驗等，準確判斷樣本的微生物污染類型。當檢測結果出來后，由專門人員負責整理結果信息，規范填寫檢測報告，經審核后蓋章，移交到分析評定人員，以此完成對罐頭食品的微生物檢測，準確評估食用價值。

3 微生物檢測技術在食品安全中的具體應用

3.1 食源性病原菌免疫學快速檢測技術及其應用

3.1.1 FAT技術

FAT技術是指熒光抗體檢測技術，其原理是依據抗原抗體反應，通過利用熒光素對抗原或者抗體進行標記，然后在與待測樣本中含有的抗原抗體相結合，借助熒光顯微鏡進行觀察判斷。該技術在實施過程中可分為直接法和間接法，直接法是指在待測樣本中直接添加已知的熒光素標記的抗血清，通過洗滌后可在熒光顯微鏡下進行觀察。間接法即是在待測樣品中加入已知細菌的特異抗體，與待測樣品進行反應和洗滌，加入熒光標記的第二和第三抗體，能夠比較準確地獲取微生物檢測結果。該技術的優勢則是簡單快捷，但樣品優勢會受到非特異性熒光的干擾，導致結果準確性受到影響[3]。

3.1.2 EIA技術

EIA技術是指免疫酶技術，其是利用酶標記抗原抗體，以此檢測相應抗原抗體的免疫技術。在當前食品安全檢測中，常用酶聯免疫吸附技術，其是將抗原抗體吸附在固相載體上，通過加入酶標記的抗體和抗原后，再加入酶的底物，從而在固相載體上實現反應。這一過程能夠生成有色產物，其產量與加入的抗原存在密切關系。因此根據產物的顏色深淺等可開展定量測定，在實踐中具有檢測速度快、特異性較強、準確性高等優勢。

3.1.3 具體應用

比如針對鮮牛奶、原料奶以及蝦仁、熟食制品等進行微生物檢測時，先科學處理被檢抗原，可應用食源性病原菌免疫學快速檢測技術。直接取選擇性增菌液SC或者M肉湯1 mL，經過離心收集沉淀后，開展洗滌、懸浮、沸水浴20 min后，放置在4 ℃環境中保存備用。在檢測過程中，將處理的抗原取50 μL，加入酶標板孔內。調節溫度到50～60 ℃進行烘干，再使用冷甲醇固定5～10 min，洗滌后添加適當濃度的酶標單抗混合液，每孔控制50 μL/孔，并在37 ℃水浴孵育2 h。對每塊備件樣本板設置陽性、陰性和空白對照孔，有助于判斷沙門氏菌。

3.2 食源性病原菌分子生物學快速檢測技術及其應用

3.2.1 基因探針技術

微生物檢測中的基因探針技術是一種利用同位素、生物素以及地高辛等開展檢測標記的方法，基于標記一小段已知序列的寡聚核苷酸，在分子雜交與目的基因相結合，根據雜交信號尋找目的基因。按照探針標記方式可分為同位素和非同位素兩種方法。其中同位素標記探針具有較強的特異性，對病原微生物的檢測速度較快。不過該方式具有一定的放射性污染，而且核酸探針的半衰期相對較短，在檢測工作中需要做好安全防護。非同位素則能夠有效解決同位素檢測存在的不足，且對人體無危害，不受紫外線照射影響等，應用效果較好[4]。

3.2.2 PCR技術

PCR技術是指多聚酶鏈反應技術，其是指利用體外酶合成特異DNA片段，并經歷高溫變性、低溫退火、適溫延伸等周期，促使DNA迅速擴增。同時該技術能夠將目的基因或DNA片段在短時間內擴增到百萬倍，并可利用肉眼直接觀察，極大地縮短了檢測時間。在實踐運用中具有較強的特異性、靈敏度高、操作簡單等特點。

3.2.3 生物芯片技術

生物芯片技術是指按照預定位置固定在固相載體上小面積內的千萬個核酸分子所組成的位點陣列。在操作中相關人員需要先標記核酸片段，促使樣品中的互補核酸片段能夠與固相載體上的核酸分子進行雜交。通過利用芯片閱讀儀，能夠比較準確的檢測出相應的雜交信號。該技術在本質上是一種高度集成化的反向斑點雜交技術，相比于傳統檢測技術而言，具有自動化程度高、操作簡單、檢測目標分子數量多、結果客觀性強等問題。不過目前在食品微生物檢測中該技術尚未實現全面推廣，其是因為芯片制作技術難度大、開展樣品制備以及標記等較為復雜[5]。但在未來發展中仍有較好的應用前景。

3.2.4 具體應用

在實際應用過程中，利用核酸探針能快速檢測李斯特菌、大腸桿菌以及志賀菌等。其可從染色體序列以及質粒中直接分離出檢測沙門氏菌的探針，但目前受限于技術以及檢測環境等因素，大多只能在實驗室中開展檢測。而多聚酶鏈反應技術在食品安全中對微生物的檢測應用，可有效檢驗食品中存在的沙門氏菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、單核細胞增多性李斯特桿菌等。該方法對大腸埃希氏菌的檢測無需富集培養，即能夠比較快速、準確地獲得檢測結果。生物芯片技術在具體應用過程中，能夠一次性檢測出多種潛在致病菌。而且檢測時間相對較短，在幾小時內即可完成全部操作步驟。比如通過引物擴增與芯片上的探針雜交，能夠直接檢測出食品樣品中的致病菌，僅需6 h獲得檢測結果[6]。

3.3 食源性致病菌生物傳感器檢測技術及其應用

對于食品安全中應用微生物檢測技術，可采用生物傳感器技術，其是食源性致病菌檢測中的重要組成部分。利用含有固定化生物物質與合適的換能器進行緊密結合，形成一種分析工具或系統。其中固定化生物物質主要包括酶、抗體、細胞、細胞器或復合體等，能夠將生化信號順利轉化為電信號，同時促使其數量化。該技術在實踐應用過程中，主要是利用致病微生物在呼吸時所產生的電子生物傳感器，根據產生的電流大小判斷微生物的濃度，進而檢測出微生物致病菌的含量。該技術主要應用在食品中大腸桿菌、李斯特菌以及沙門氏菌的檢測，可在幾分鐘內完成檢測活動，檢出限達到0.1～1.0 ng·mL-1，對于細菌毒素、真菌毒素等檢測具有較好的檢測效果。

4 結語

綜上所述，針對不同品種的食品選擇適當的微生物檢測技術，如食源性病原菌免疫快速檢測技術、分子生物學快速檢測技術以及致病菌生物傳感器檢測技術等，側重多種技術的結合，形成高效的組合檢測形式，進一步加快食品微生物檢測效率、保證檢測結果具有客觀性、可靠性，推動食品安全向前發展，維護社會和諧穩定。