乙酰化白藜蘆醇對脂多糖誘導急性肺損傷中微循環修復作用機制探究

閆雪 崔蕊 熊曉毅 張敏龍

1咸陽職業技術學院醫學院712000;2空軍軍醫大學唐都醫院呼吸科,西安710038

急性肺損傷是由多種因素 (如感染、創傷、休克、吸入理化物質等)引起的以頑固性呼吸困難及低氧血癥為主要特征的一類肺部疾病,如未得到及時診治,會逐漸發展成為ARDS。感染是引起急性 肺 損 傷 最 常 見 的 因 素, 而 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)作為革蘭陰性菌細胞壁主要成分,是造成肺部感染的重要原因。多項研究表明,LPS誘導的急性肺損傷最主要的病理生理改變是肺組織水腫及肺泡炎癥反應[1-2]。在多種類型的肺損傷中,肺微血管內皮細胞通透性的增加是引起肺組織水腫及炎癥細胞滲透的關鍵改變[3]。而滲透至肺泡腔中的炎癥細胞被LPS激活后產生的炎癥因子又會進一步加重肺組織的炎癥反應[4-5]。因此,肺微血管內皮細胞通透性的改變在肺損傷形成過程中起到較為重要的作用。

白藜蘆醇是提取于葡萄及部分堅果中的一種天然物質。乙酰化白藜蘆醇是白藜蘆醇的前體藥物,其在藥代動力學及生物利用度等方面均優于白藜蘆醇。前期研究證實,乙酰化白藜蘆醇能夠減輕其他類型引起的肺損傷及肺組織炎癥[6-7],但能否減輕LPS誘導的肺損傷及修復肺組織微循環,仍需進一步研究。

本研究通過大鼠及肺微血管內皮細胞的LPS急性肺損傷模型,探究了乙酰化白藜蘆醇對LPS誘導的肺微循環損傷的修復作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 32 只健康雄性SD 大鼠,清潔級,體質量200 g左右,空軍軍醫大學實驗動物中心提供。采用完全隨機方法將實驗大鼠分為4組:空白對照組、LPS 處理組、乙酰化白藜蘆醇預處理組、白藜蘆醇預處理組,每組8只。造模前1 h,空白對照組、LPS處理組大鼠分別以生理鹽水灌胃,乙酰化白藜蘆醇預處理組大鼠以150 mg/kg乙酰化白藜蘆醇灌胃,白藜蘆醇預處理組大鼠以150 mg/kg白藜蘆醇灌胃。LPS 處理組、乙酰化白藜蘆醇預處理組、白藜蘆醇預處理組制作LPS誘導的肺損傷模型,造模后采用放血法處死,收集肺組織標本。動物模型的制備:大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (1.5 ml/kg)麻醉,仰臥固定位,頸正中切口暴露氣管,取1 ml注射器插入氣管,在4 min之內緩慢注入5 mg/kg LPS混懸液。本實驗經空軍軍醫大學動物倫理及使用委員會批準。

1.2 細胞培養及處理 大鼠肺微血管內皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)用含有100 U/ml青鏈霉素、25 mg/L內皮生長因子和20%胎牛血清的DMEM 培養基培養。LPS刺激前1 h,分別用200μmol/L 乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇進行預處理,之后用5 mg/L LPS處理細胞4 h。

1.3 實驗試劑 乙酰化白藜蘆醇及白藜蘆醇由空軍軍醫大學生化教研室合成及提供,高效液相純度達到99%以上,乙酰化白藜蘆醇及白藜蘆醇用5‰羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液,灌胃給藥。LPS購自美國Sigma公司,用生理鹽水制成混懸液后氣管內滴注給藥。腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-1β酶聯免疫吸附試驗試劑盒購于美國R&D 公司。FAK 和cofilin抗體購于美國Cell Signaling公司,β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 病理學檢查 取每組大鼠右下肺組織迅速放入4%多聚甲醛中固定24 h,脫水,然后進行石蠟包埋并切片,HE染色,光學顯微鏡觀察。

1.4.2 肺組織濕/干重比值及肺組織通透性檢測 取各組大鼠相同部位肺組織,用濾紙擦拭血跡后稱重為肺濕重,將標本置于70 ℃烘箱中72 h 至恒重,稱量干重,計算濕/干重比值。肺組織通透性檢測采用伊文思藍方法。大鼠麻醉前30 min將伊文思藍溶液 (20 mg/kg)注入到靜脈中,實驗結束后,用生理鹽水注入大鼠右心室沖血管,直至左心房流出液變清。取下右肺中葉并在60 ℃下烘干72 h,然后室溫下用多聚甲醛浸泡24 h提取伊文思藍,用分光光度計 (620 nm)檢測上清液伊文思藍濃度。

1.4.3 TNF-α和IL-1β檢測 采用酶聯免疫吸附試驗法檢測肺組織勻漿中的TNF-α和IL-1β的含量,具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.4 蛋白質印跡法檢測FAK 和cofilin相關蛋白表達 取相同位置適量的肺組織,加入蛋白裂解液于冰上進行勻漿,離心并收集上清液,定量,用沸水煮15 min,電泳并轉膜。封閉2 h,加入1∶1 000稀釋的一抗,4 ℃過夜,然后加入1∶5 000稀釋二抗,37℃溫育1 h,ECL顯色,避光保存并照相,做灰度掃描處理。

1.4.5 免疫熒光觀察RPMVECs細胞骨架變化 進行細胞爬片,處理后的細胞用4%多聚甲醛固定10 min,0.1% Triton X-100 穿透10 min,然后2%血清封閉30 min,加入熒光標記的Alexa488-Phalloidin 并在室溫下避光孵育60 min,最后DAPI染核,封片,熒光顯微鏡觀察照相。

1.5 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。全部數據以±s表示,組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理改變、肺濕/干重比值及肺組織通透性改變 與空白對照組比較,LPS 組大鼠肺組織結構出現紊亂,肺間質可見出血、滲出,并可見炎癥細胞浸潤,且肺濕/干重比值及肺組織通透性明顯增加(P值均＜0.01)；與LPS 組比較,乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇預處理組大鼠肺組織結構尚清晰,間質滲出、出血和炎細胞浸潤等改變明顯減輕,肺濕/干重比值及肺組織通透性也顯著減輕(P＜0.01或P＜0.05),且乙酰化白藜蘆醇預處理組減輕更為明顯。見圖1～3。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現 A:空白對照組；B:脂多糖組；C:乙酰化白藜蘆醇預處理組；D:白藜蘆醇預處理組 HE ×200

2.2 肺組織炎癥因子表達的改變 與空白對照組比較,LPS組大鼠肺組織中TNF-α和IL-1β均明顯增加 (P值均＜0.01)；與LPS 組比較,乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇預處理組大鼠肺組織中TNF-α和IL-1β的增加出現了顯著的抑制 (P值均＜0.01),且乙酰化白藜蘆醇預處理組更為明顯。見圖4、5。

圖2 各組大鼠肺組織濕/干重比值的比較

圖3 各組大鼠肺組織通透性的比較

2.3 大鼠肺組織FAK-cofilin通路改變 與空白對照組比較,LPS組大鼠肺組織中FAK 及其下游cofilin均出現了明顯的激活(磷酸化)(P值均＜0.01)；與LPS組比較,乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇預處理組大鼠肺組織中FAK-cofilin的激活出現了顯著的抑制(P值均＜0.01),且乙酰化白藜蘆醇預處理組更為明顯(圖6)。

圖4 各組大鼠肺組織中TNF-α水平的比較

圖5 各組大鼠肺組織中IL-1β水平的比較

2.4 RPMVECs中FAK-cofilin 通路改變 與空白對照組比較,LPS組RPMVECs中FAK 及其下游cofilin均出現了明顯的激活 (磷酸化) (P值均＜0.01)；與LPS組比較,乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇預處理組RPMVECs中FAK-cofilin的激活出現了顯著的抑制(P值均＜0.01),且乙酰化白藜蘆醇預處理組更為明顯(圖7)。

2.5 RPMVECs細胞骨架的改變 與空白對照組比較,LPS組RPMVECs中細胞骨架蛋白出現了聚集,細胞間縫隙增大；與LPS 組比較,乙酰化白藜蘆醇和白藜蘆醇預處理組RPMVECs中細胞骨架蛋白聚集現象出現了較為明顯的抑制,且乙酰化白藜蘆醇預處理組更為明顯(圖8)。

3 討論

LPS誘導的急性肺損傷最主要的病理生理改變是肺組織水腫及肺泡炎癥反應。LPS 作用于肺組織屏障后(肺微血管內皮細胞及上皮細胞),引起肺組織屏障的損傷及細胞間隙的增加,最終導致水腫液及炎癥細胞滲出到肺泡組織中,進一步引起肺組織炎癥[8-9]。在本研究中,筆者觀察到LPS作用后,大鼠肺泡中伴有出血、水腫以及大量炎細胞浸潤,炎癥因子的表達也增高。同時,LPS 作用后引起了肺組織通透性增加,且通透性增加是通過細胞骨架重構引起。此外,該作用是通過FAKcofilin信號通路的激活達成。通過乙酰化白藜蘆醇的預處理,肺水腫和炎癥反應得到了一定程度的減輕,同時肺組織通透性也得到了改善；在細胞層面,乙酰化白藜蘆醇減輕了LPS誘導的細胞骨架重構,并且抑制了FAK-cofilin信號通路的激活。

圖6 各組大鼠肺組織FAK-cofilin通路激活情況 A:電泳圖；B:FAK 蛋白表達柱狀圖；C:cofilin蛋白表達柱狀圖

圖7 各組RPMVECs中FAK-cofilin通路激活情況 A:電泳圖；B:FAK 蛋白表達柱狀圖；C:cofilin蛋白表達柱狀圖

圖8 各組大鼠肺微血管內皮細胞中細胞骨架的改變情況 A:空白對照組；B:脂多糖組；C:乙酰化白藜蘆醇預處理組；D:白藜蘆醇預處理組

目前急性肺損傷的相關治療仍集中在機械通氣、吸氧、物理排痰、抗感染等對癥治療方面。盡管有很多藥物也應用于LPS誘導的急性肺損傷和ARDS (如糖皮質激素可促進炎癥及水腫吸收),但這些治療并沒有明顯的降低死亡率,同時也沒有較為特效的治療藥物。乙酰化白藜蘆醇是白藜蘆醇的前體物質,其應用于機體后,通過代謝分解,會在肺組織中存在較高濃度的白藜蘆醇[10-12]。白藜蘆醇此前已經證實其有預防腫瘤、抗氧化以及抗炎等重要作用。但白藜蘆醇作為藥物有著自身缺陷,比如存在半衰期短、生物利用度低等問題。因此,乙酰化后的白藜蘆醇很好地解決了現有的問題。

肺微循環在肺損傷的形成中起到了重要作用。大量的研究表明,多種因素造成的肺損傷中存在肺組織微血管通透性的增加,從而進一步使血液中的液體及炎癥細胞滲入到肺泡中,最終在肺泡中聚集,引起肺組織炎癥反應,造成更多的損傷。因此,對于肺組織微循環的修復是肺損傷治療的重要方向。在本研究中也發現了 LPS 作用于RPMVECs后,細胞骨架結構產生改變,細胞間隙增加,造成了水腫液及炎癥細胞大量的滲漏,從而加重肺組織炎癥。乙酰化白藜蘆醇作用后,減輕了LPS造成的肺組織水腫以及炎癥反應,且效果顯著優于白藜蘆醇的作用。FAK 是局灶性黏附復合物的關鍵成分,它將細胞內黏著斑與胞質信號通路聯系起來,而FAK 分子的磷酸化能夠調節細胞骨架的改變。cofilin是一種肌動蛋白結合蛋白,在肌動蛋白重組中有重要作用。研究表明cofilin 能夠被FAK 激活,起到調節細胞骨架結構的作用[13-14]。在本研究中,LPS 的刺激引起了肺組織及RPMVECs中FAK-cofilin的激活,同時也引起了細胞骨架的聚集,導致細胞間隙增加。而乙酰化白藜蘆醇的作用能夠抑制FAK-cofilin的激活,同時能夠抑制細胞骨架蛋白的聚集及細胞間隙的增加。這些結果部分地解釋了乙酰化白藜蘆醇在LPS誘導的肺損傷中的作用機制,且上述實驗證實了對于LPS肺損傷微循環的改善,乙酰化白藜蘆醇的效果要明顯優于其前體物質白藜蘆醇,同時也為乙酰化白藜蘆醇的臨床應用提供了實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突