GRP78、Derlin-1在肺纖維化大鼠模型中的表達研究

劉賁 李旭梅 戴曦 袁競 詹倩 王榮麗

特發性肺纖維化( IPF)是一種常見的慢性進行性呼吸系統疾病，以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞/肌成纖維細胞聚集和細胞外基質沉積為特征[1]。病因及病理生理過程復雜，尚無有效的臨床治療手段。既往研究表明氧化應激和過度炎癥反應在肺纖維化中起到重要作用[2]，而內質網應激(ERS)與氧化應激反應、細胞凋亡有著緊密關系,并與炎癥相互關聯[3-4]，過度的ERS還會增加肺纖維化的易感性[5]，ERS與肺纖維化似乎有密切聯系。在ERS級聯反應中，GRP78的表達上調被認為是ERS和UPR的激活標志[6]。持續的ERS刺激Derlin-1的表達，參與ERAD緩解ERS，避免細胞凋亡[7-8]。本研究通過分析Derlin-1和GRP78在肺纖維化動物模型中的的表達，探討ERS在肺纖維化過程中的作用，尋找新的診療靶點。

資料和方法

一、實驗動物、藥品、試劑

清潔健康雄性SD大鼠50只，8～10周齡，體質量(210±10)g，購于西南醫科大學動物實驗中心，常規飼養1周后進行造模。質量濃度20%的百草枯(先正達南通作物保護有限公司)；Masson三色染色試劑盒(北京雷根生物科技有限公司)；DERLIN-1抗體(北京布爾森股份有限公司)；GRP78抗體(美國BioWorld公司)；SP試劑盒(邁新公司)；ELISA試劑盒(R&D公司)。

二、模型制備

將50只大鼠隨機分為染毒組和對照組，染毒組根據染毒后不同時間隨機分為Day1、Day7、Day14、Day21共4個亞組，每組均為10只。染毒組通過腹腔注射15 mg/kg劑量百草枯誘導小鼠肺纖維化；對照組腹腔注射等量生理鹽水。通過觀察大鼠食欲不振、反應遲緩、斜視、垂發、身體卷曲、缺乏運動和呼吸困難等現象判斷造模是否成功，剔除不符合判定標準或死亡模型后，每組最終有6只大鼠納入研究結果分析。所有染毒組大鼠分別于染毒后第1、7、14、21天處死；對照組在第1天處死，隨機抽取6只作為對照。

三、計算肺系數

肺系數常作為監測實驗動物肺水腫的指標。大鼠處死后稱重，開胸分離雙肺，觀察肺組織病理變化；用濾紙吸干雙肺表面的液體后稱取濕重，按公式(肺系數=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)×100%)計算肺系數。

四、肺組織HE染色及Masson染色

分離左肺下葉制作石蠟切片，行常規HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變，參照Szapiel標準[9]評定肺組織炎癥程度和纖維化程度(表1)。

表1 Szapiel等的肺組織病理評分標準

五、免疫組化檢測Derlin-1和GRP78的表達

在200倍顯微鏡下仔細觀察制備好的肺組織切片，每張切片隨機選取5個視野，采用Img-Pro6.0圖像分析系統測量陽性細胞的平均光密度(OD)值，分析肺組織切片標本的Derlin-1、GRP78陽性表達強度。

六、Elisa檢測肺組織中Derlin-1的表達水平

分別稱取200mg肺組織/只，用冰凍的生理鹽水漂洗干凈后分別加入2 mL冰凍的生理鹽水，剪碎后制備組織勻漿，低溫離心機中以3 000 r/min、4℃的條件下離心15分鐘，取上清液，-80℃凍存備用。按照Elisa試劑盒操作說明書檢測肺組織勻漿樣本中Derlin-1的表達水平。

七、統計分析

用SPSS 17.0軟件進行分析，計量數據以均數±標準差表示，各多組間的比較采用單因素方差分析，以SNK法進行多重比較。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、大鼠染毒后的一般情況

對照組大鼠表現正常。而染毒組大鼠在染毒30分鐘后分別出現不同程度的中毒現象，可觀察到大鼠出現明顯反應遲鈍、食欲不振、毛發蓬松、呼吸急促、鼠尾發紺、喜蜷縮少動、易捕捉等現象。1天后，染毒組上述癥狀加重，部分大鼠口鼻紫紺甚至死亡。第7天起，染毒組存活下的大鼠出現精神好轉、進食逐漸增多、體重逐漸上升表現，至第21天大鼠上述急性期癥狀基本消失，但較對照組大鼠生長欠佳。

二、肺大體形態觀察及肺系數評定

對照組大鼠的肺組織光滑紅潤，質地柔軟，富有彈性。Day1組肺組織可見輕度水脹、充血；Day7組較Day1組出現肺淤血，水腫加重；Day14組肺組織水腫淤血明顯，肺局灶性實變，彈性下降；Day21組大鼠肺組織實變面積較大，體積明顯縮小，顏色蒼白，質地堅硬。

肺系數分析結果顯示：單因素方差分析組間比較F值為98.416，P<0.001。兩兩比較時，Day1、Day7、Day14組大鼠的肺系數均高于對照組(P<0.05)，Day7組最高，Day14組較Day7組開始出現下降，組間比較均為P<0.05；而Day21組肺系數與對照組比較，差異無統計學意義(P=0.561，P>0.05)(見表2)。

表2 大鼠肺系數評定

三、肺組織HE染色病理表現及炎癥評分

對照組大鼠肺泡結構清晰完整，無充血、水腫、炎性滲出；Day1組可見毛細血管擴張充血，伴少量炎癥細胞浸潤；Day7組部分支氣管上皮細胞脫落，血管明顯充血，肺泡炎癥反應明顯，腔內可見水腫液，間隔增厚；Day14組部分肺泡塌陷，結構紊亂，肺間質增厚，炎性細胞浸潤減少，伴有較多成纖維細胞增生；Day21組肺組織炎癥反應消失，結構明顯破壞，肺泡間隔增寬、管腔縮小，大量纖維細胞增生。結果見表3，圖1。單因素方差分析組間比較F值為147.469，P<0.001。

圖1 大鼠肺組織HE染色(×100)

表3 肺泡炎癥程度評分

四、肺組織Masson染色及肺纖維化評分

正常對照組肺組織結構清晰，周圍僅有少量藍染的生理性膠原纖維；Day1組肺組織可見藍染的膠原纖維增多；Day7組部分肺組織被纖維細胞和成纖維細胞所替代，可見少許藍染膠原沉積；Day14組膠原纖維增生，藍染面積增大，肺間質呈纖維性增生；Day21組藍染膠原沉積明顯。評分顯示染毒組肺纖維化評分均高于對照組，且隨染毒時間延長評分越來越高，除Day1組，Day7、Day14和Day21組與對照組相比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中Day14組較Day7組評分明顯升高(P<0.05)，而Day14組與Day21組比較差異無統計學意義(P>0.05)，單因素方差分析組間比較F值為206.982，P<0.001(見表4、圖2)。

圖2 大鼠肺組織Masson染色(×100)

表4 肺纖維化程度評分

五、免疫組化觀察肺組織中Derlin-1、GRP78表達水平

顯微鏡下肺組織細胞核呈藍色，Derlin-1陽性表達為棕黃色顆粒。免疫組化結果顯示Derlin-1、GRP78表達部位相似，均主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的胞漿中。分析Derlin-1陽性表達水平發現，染毒組的Derlin-1表達均高于對照組(P<0.05)，于Day14組表達最高，與Day7組相比較(P<0.05)；Day21組有所下降，Day1組、Day7與Day21組兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)，單因素方差分析組間比較F值為12.692，P<0.001(見表5、圖3)。分析GRP78陽性表達水平發現，染毒組的GRP78表達均高于正常對照組(P<0.05)，于Day7組表達最高，Day14、Day21組較Day7組有所下降，各組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，單因素方差分析組間比較F值為303.541，P<0.001(見表6、圖4)。

圖3 大鼠肺組織免疫組化檢測Derlin-1表達(×100)

圖4 大鼠肺組織免疫組化檢測GRP78表達(×100)

表5 大鼠Derlin-1表達水平

表6 大鼠GRP78表達水平

六、肺組織勻漿中Derlin-1的表達

通過ELisa法檢測肺組織勻漿中Derlin-1的表達水平，結果顯示Derlin-1隨染毒時間緩慢升高，于Day14組表達最高，Day21組較Day14組表達降低，各組間兩兩相互比較差異均有統計學意義(P<0.05)，單因素方差分析組間比較F值為552.184，P<0.001。該結果與免疫組化觀察結果趨勢一致(見表7)。

表7 大鼠肺組織勻漿中Derlin-1表達水平

討 論

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。該疾病的發生發展過程尚不完全明確，現認為與細菌、病毒感染，藥物，自身免疫性疾病，煙草及粉塵接觸，以及環境污染有一定的關系[10]。近年來發病人數逐年增加，臨床治療手段以糖皮質激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物為主，但療效不盡人意，造成了沉重的公共衛生經濟負擔，急需新的治療靶點。真核細胞為應對內質網腔內未折疊或錯誤折疊的蛋白質及其異常聚集，啟動內質網應激級聯反應，折疊蛋白反應(UPR)、整合應激反應(ISR)和內質網相關降解(ERAD)被激活，其目的是阻止蛋白質翻譯，改善蛋白質折疊，維持細胞內穩態，避免因未折疊或錯誤折疊蛋白的積累而導致細胞死亡[11-12]。既往多項研究表明通過抑制ERS能夠緩解炎癥，抑制細胞凋亡，減少組織損傷，在哮喘、ARDS、COPD等呼吸系統疾病發生發展中起到重要作用。近年來許多研究發現ERS與肺纖維化也有密切關系[13-14]，本文通過百草枯染毒復制肺纖維化動物模型，觀察GRP78和Derlin-1的表達以探尋內質網應激與肺纖維化的關系。GRP78是內質網腔內的分子伴侶蛋白，當發生ERS時，其與內質網的3種跨膜蛋白解離并主動與未折疊或錯誤折疊蛋白結合，GRP78的上調標志著ER stress的啟動[15]。實驗中我們用免疫組化的方法檢測肺組織中GRP78表達，結果顯示，GRP78于染毒1天后表達明顯升高，在染毒第7天達到最高后開始下降，第21天較第14天明顯下降(P<0.001)，仍高于對照組，各組數據相比較，差異均具有統計學意義。因此我們認為染毒大鼠肺組織內確實發生了ERS。早期機體啟動ER stress，GRP78于染毒早期升高，促進錯誤折疊及未折疊蛋白的折疊、轉運、降解，減少細胞損傷；后面GRP78的表達開始降低，表明內質網損傷已不可逆，無法恢復正常功能時則啟動凋亡信號通路，清除受損肺泡上皮細胞，成纖維細胞增殖，膠原沉積，最終導致肺纖維的形成。免疫組化結果顯示Derlin-1主要表達于肺泡上皮細胞和血管內皮細胞胞漿中，免疫組化、ELISA兩種方法檢測Derlin-1的表達均顯示，染毒組中Derlin-1的表達隨時間先升高后降低，Day14組表達最高，Day21組有所下降但仍高于Day1、Day7組，各組數據差異具有統計學意義。綜上表明百草枯中毒后誘導了肺泡上皮細胞發生ERS。且為應對持續存在或過強的ERS誘導細胞凋亡，作為一種保護性的內質網應激蛋白Derlin-1在染毒早期升高，阻止過強的ER相關性凋亡的出現。隨時間延長，Derlin-1的表達有所下降，可能系已出現不可逆轉的肺損傷，ERS啟動的凋亡作用超過了其保護性作用，ERS持續性發展，進一步促進了肺纖維化的形成，并最終發展成為不可逆性的肺間質纖維化。實驗通過對各組病理組織進行肺泡炎和肺纖維化的程度的評分，對肺系數進行測定，結果對照顯示早期示以急性肺泡炎反應為主，后期則出現肺間質的纖維化，近年來也有越來越多的研究表明炎癥反應與內質網應激有著緊密聯系[16]，而持續的炎癥反應和異常修復，也是肺纖維化的誘因[17]，故內質網應激和肺纖維化之間也有某種聯系。

目前認為百草枯在體內誘導急性氧化還原反應，不但導致直接損傷，還使得活性氧物質(ROS)過度激活，調節肺內不同的促炎介質促進炎癥反應，誘導前纖維化因子的產生，形成肺損傷，最終導致肺纖維化[18]。我們通過本研究，在百草枯染毒大鼠肺組織細胞中觀察到GRP78和Derlin-1的表達水平在早期上升，證實了內質網應激參與了肺纖維化的病理過程，其規律性變化亦驗證了內質網應激與肺纖維化的形成關系密切。該研究結果為進一步揭示肺纖維化的分子機制，以為尋求新的診治靶點提供了可靠的基礎研究依據。