陜西泡菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其發酵特性與耐受性研究

熊蝶，袁嵐玉，李媛媛，范鵬飛，馮武

(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

泡菜是中國傳承數千年的傳統發酵食品，因其口感酸香脆嫩、鮮香開胃而廣受人們喜愛[1]。隨著泡菜產業的發展，其工業化程度逐漸提高，產品質量也更加穩定，但仍然存在許多問題[2]。泡菜在制作過程中會產生亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽含量超標也是泡菜常見的安全問題之一[3]。亞硝酸鹽食用過量會對人體造成危害，一次食用達到中毒劑量會造成低氧血癥等急性毒性危害，同時亞硝酸鹽在體內與胺類物質結合生成的亞硝胺作為一種強致癌物，會增加患癌癥的風險，因此控制泡菜中亞硝酸鹽的產生尤為重要[4-5]。

乳酸菌是一類細菌的統稱，它呈革蘭氏陽性，一般被認為是安全的細菌，有許多研究表明了乳酸菌降解亞硝酸鹽的性質[6]。朱軍莉等[7]從自制發酵泡菜中分離出1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，其培養72 h后對125 mg/L亞硝酸鹽的降解率達到95.6%。王英等[8]從自制發酵酸豆角中分離出1株植物乳桿菌，培養48 h后對200 mg/L亞硝酸鹽的降解率達到91.64%。同時乳酸菌能夠發酵糖產酸，在泡菜發酵的過程中占主導地位，因此將具有良好發酵性質的乳酸菌應用于泡菜發酵中，是一種便捷有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量并提升泡菜安全性的方法[9]。此外，乳酸菌還被報道有降低血清膽固醇[10]、緩解乳糖不耐受癥[11]以及提高免疫[12]等益生作用，因此隨泡菜一起進入人體的乳酸菌有可能在人體內發揮益生作用。

本研究主要從陜西家庭自制泡菜中篩選出高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，并對其進行鑒定，然后對篩選出的菌株進行發酵特性與耐受特性的研究。通過研究其產酸和降解亞硝酸鹽的能力，以及耐亞硝酸鹽和耐NaCl特性，為開發菌株應用于泡菜生產發酵的潛力提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西家庭自制泡菜。

MRS肉湯、MRS瓊脂、乳酸菌成套生化鑒定管，青島海博生物技術有限公司；硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaCl、NaNO2，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan GO全波長讀數儀，美國賽默飛世爾公司；UV1800紫外-可見分光光度計，日本島津公司；VD-1320超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SHP-250生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；AL204電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

吸取25 mL泡菜汁液到50 mL MRS肉湯中，于37 ℃下增菌培養24 h，然后用生理鹽水進行梯度稀釋，取合適稀釋度的菌液0.1 mL涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂平板上，并于37 ℃下培養48 h。挑取平板上有明顯溶鈣圈且表面濕潤的單菌落，于MRS平板上反復劃線純化，然后對純化菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，將革蘭氏陽性與過氧化氫酶陰性菌株進行4 ℃斜面保存以及-20 ℃甘油管保存，并進行后續實驗。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

1.3.2.1 亞硝酸鹽的測定

基于GB/T 5009.33—2016中的分光光度法[13]，并結合茹曉[14]測定亞硝酸鹽含量的方法進行修改。取離心去菌體后發酵液1 mL，依次加入2.5 mL硼砂、1 mL亞鐵氰化鉀、1 mL乙酸鋅，而后用超純水定容至50 mL，混勻后靜置30 min，用濾紙過濾得到濾液備用。加入合適量的濾液到50 mL比色管中，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，用超純水定容至50 mL，混勻后靜置15 min，以不添加濾液的零管調零，于538 nm波長下測定吸光值。同時做各不同添加量濾液對應的試劑空白。按照GB/T 5009.33—2016中的分光光度法測定并繪制亞硝酸鹽含量標準曲線，根據標準曲線得到亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽降解率按照公式(1)計算：

(1)

式中：R表示亞硝酸鹽降解率，%；C0表示培養基中NaNO2初始含量，mg/L；C1表示不同培養時刻培養基中NaNO2含量，mg/L。

1.3.2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

參考郭志華等[15]的方法，對降解亞硝酸鹽的乳酸菌進行初步篩選。將上述純化保存的菌株接種到MRS肉湯中活化2次，并以體積分數為2%的添加量將活化菌液接種于含有150 mg/L NaNO2的10 mL MRS肉湯中，37 ℃下培養48 h。向培養基中加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后靜置15 min，觀察各菌株培養基的顏色，與添加150 mg/L NaNO2的MRS肉湯以及不添加 NaNO2的MRS培養基進行顏色對比，選出顏色淺的菌株進行后續篩選。

1.3.2.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

將初篩中得到的菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，然后以體積分數為2%的接種量接種到含有150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，在37 ℃下培養48 h，并按照1.3.2.1中的方法測定48 h內菌株對亞硝酸鹽的降解率，篩選出降解亞硝酸鹽效果好的菌株。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

使用乳酸菌成套生化鑒定管測定菌株的糖發酵結果，結合《常見細菌系統鑒定手冊》[16]初步判定菌株種類。

1.3.3.2 16S rDNA鑒定

將活化的菌液交于上海生工生物工程有限公司進行16S rDNA的測序，將得到的序列與NCBI中序列進行BLAST同源性對比，并用MEGA 7.0繪制系統進化樹，最終確定菌株種屬。

1.3.4 生長曲線的測定

將菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，并以體積分數為2%的接種量接種于MRS肉湯中，于37 ℃培養，每2 h測定OD600nm吸光值。

1.3.5 乳酸菌發酵特性的測定

1.3.5.1 產酸能力的測定

將菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，并以體積分數為2%的接種量接種于MRS肉湯中，于37 ℃培養72 h，在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h測定發酵液pH值及總酸含量。總酸含量按照GB/T 12456—2008[17]中的酸堿滴定法測定。

1.3.5.2 降解亞硝酸鹽速率的測定

將菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，并以體積分數為2%的接種量接種于含有150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，于37 ℃培養48 h，在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h測定發酵液pH值以及亞硝酸鹽降解率。按照1.3.2中的方法進行測定。

1.3.6 乳酸菌耐受性測定

1.3.6.1 耐亞硝酸鹽能力的測定

將菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，以體積分數為2%的接種量接入含有50、100、150、200、250、300 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，以不添加NaNO2的肉湯作為對照，于37 ℃培養24 h，測定0和24 h的OD600nm吸光值。

1.3.6.2 耐NaCl能力的測定

將菌株接種到MRS肉湯培養基中活化2次，以體積分數為2%的接種量接入含有20、40、60、80、100、120、140 g/L NaCl的MRS肉湯中，以不添加NaCl的肉湯作為對照，于37 ℃培養24 h，測定0和24 h的OD600nm吸光值。

1.3.7 數據統計與分析

所有實驗重復2次，用SPSS 23.0進行顯著性分析，用Origin 2016繪圖，數據表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌初篩與復篩結果

從陜西泡菜中分離出15株有明顯溶鈣圈的菌株，其革蘭氏染色結果均為陽性，過氧化氫酶實驗結果均為陰性，初步判定為乳酸菌，編號為PC1～PC15。將15株菌接種至MRS肉湯中活化時，有9株菌生長渾濁，在含有150 mg/L NaNO2的肉湯培養基中培養48 h后，直接顯色結果如圖1，其中PC5、PC8、PC10、PC11和PC14的顏色較淺，推測培養基中殘留的NaNO2含量較少，將此5株菌進行復篩。

5株菌的復篩結果如表1所示。培養36 h后，5株菌的亞硝酸鹽降解率均達到80%以上，其中菌株PC5和菌株PC11在培養到12 h時，其亞硝酸鹽降解率遠高于其他3株菌。在培養至12 h時，菌株PC5的亞硝酸鹽降解率顯著高于菌株PC11，并且在發酵過程中，菌株PC5的亞硝酸鹽降解率一直高于PC11，因此選擇菌株PC5作為后續的研究對象。

圖1 部分菌株的培養基中NaNO2顯色反應結果Fig.1 Color reaction results of NaNO2 in the culture medium of partial strains

2.2 生化鑒定結果

圖2顯示了菌株PC5的革蘭氏染色圖和菌落形態圖，菌株PC5為桿狀，其菌落乳白色濕潤且凸起。表2顯示了菌株PC5發酵糖類的特性，其中菌株PC5可以發酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖等10種糖。在參考《常見細菌鑒定手冊》[16]中關于部分乳桿菌的部分發酵特性后，推測其有可能是植物乳桿菌或敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)。

表1 五株菌48 h內的亞硝酸鹽降解率 單位：%

a-革蘭氏染色結果;b-菌落形態圖2 菌株PC5的菌落形態和革蘭氏染色結果Fig.2 Colony morphology and Gram staining result of strain PC5注：革蘭氏染色鏡檢放大倍數為1 000倍

表2 菌株PC5糖發酵反應結果Table 2 Sugar fermentation reaction results of strain PC5

2.3 16S rDNA鑒定

菌株通過Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，然后用細菌引物進行PCR擴增，最后回收純化后測序，將測序結果用BLAST進行對比，用MEGA 7.0進行系統進化樹的繪制。如圖3所示，菌株PC5與植物乳桿菌AMT74419的同源性為100%，綜合生化鑒定結果，菌株PC5為植物乳桿菌。

圖3 菌株PC5的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain PC5

2.4 生長曲線的測定

由圖4可知，菌株PC5的對數生長期是2～16 h，16 h后進入穩定期，因此活化時培養至16 h最優。菌株PC5延滯期短，2 h時便可進入對數期，菌量迅速增加，更適宜于培養發酵。

圖4 菌株PC5的生長曲線Fig.4 The growth curve of strain PC5

2.5 乳酸菌發酵特性的測定

2.5.1 產酸能力的測定

由圖5可知，在菌株PC5發酵12 h時，發酵液pH值已經降低至3.96±0.00，發酵24 h時，pH值降至3.73±0.01。菌株PC5發酵液的滴定總酸在4～24 h內迅速積累，在24 h時已達到(1.99±0.01)%，發酵液中總酸的迅速積累使得pH值迅速下降。菌株PC5發酵液的滴定總酸和pH值在24 h之后均趨于穩定，當發酵至72 h，發酵液pH值達到3.72±0.00，滴定總酸為(2.02±0.05)%。菌株PC5發酵產酸能將培養基pH值降低至3.72左右，有利于泡菜的發酵酸化和抑制有害菌。

圖5 菌株PC5培養過程中pH值與滴定總酸的變化Fig.5 Changes of pH value and total acid titration during the culture of strain PC5

2.5.2 降解亞硝酸鹽速率的測定

由圖6可知，在添加150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，菌株PC5發酵8 h可降解(49.46±3.65)%的NaNO2，此時發酵液的pH值為4.21±0.03。當發酵至12 h時，菌株PC5的亞硝酸鹽降解率達到(83.31±3.96)%，發酵液pH值降低至3.93±0.01。而發酵至24 h時，菌株PC5亞硝酸鹽降解率可達(99.37±0.56)%，此時發酵液的pH值降低至3.74±0.01，此后pH值趨于穩定，NaNO2基本降解完全。在張慶芳等[18]的研究中指出，亞硝酸鹽的降解主要分為2個階段，在發酵液pH值高于4.5時，乳酸菌降解亞硝酸鹽以亞硝酸鹽還原酶降解為主，當發酵液pH值低于4.0時，主要是酸降解亞硝酸鹽，由此推測，菌株PC5降解亞硝酸鹽的方式既有酶降解也有酸降解。

圖6 菌株PC5培養過程中pH值與亞硝酸鹽降解率的變化Fig.6 Changes of pH value and nitrite degradation rate during the culture of strain PC5

2.6 乳酸菌耐受性的測定

2.6.1 耐亞硝酸鹽能力的測定

由圖7可知，菌株PC5在含有50和100 mg/L NaNO2的培養基中生長24 h，OD600nm能達到0.80以上，與不添加NaNO2時無顯著性差異。在NaNO2質量濃度為150和200 mg/L時，菌株PC5生長24 h后，OD600nm在0.50～0.70。當NaNO2質量濃度達到250和300 mg/L時，菌株PC5生長24 h后OD600nm在0.30～0.50，顯著低于NaNO2質量濃度為200 mg/L時菌株PC5的OD600 nm。乳酸菌在泡菜發酵過程中會面臨亞硝酸鹽含量升高的問題，因此作為接種發酵的乳酸菌需要具備一定程度的亞硝酸鹽耐受能力。由圖7可見，菌株PC5對ρ(NaNO2)≤200 mg/L具有較強的耐受能力，對250～300 mg/L的高質量濃度NaNO2具有一定程度的耐受能力，因此PC5具備成為接種發酵泡菜的潛力。

圖7 菌株PC5在不同質量濃度NaNO2中的生長情況Fig.7 The growth of strain PC5 under different mass concentrations of NaNO2注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6.2 耐NaCl能力的測定

泡菜發酵時通常需要加入一定量的食鹽，既能調節泡菜風味也能抑菌，因此適合發酵泡菜的乳酸菌應該具備一定程度的耐NaCl能力[19]。由圖8可知，在含有0～60 g/L NaCl的培養基中，菌株PC5培養24 h后均可以生長，且OD600nm可達到0.60以上。當NaCl質量濃度為0和20 g/L時，菌株PC5生長最好，其中20 g/L NaCl更適合PC5的生長，OD600nm可達到1.15。當NaCl質量濃度為40 g/L時，菌株PC5的生長與不添加NaCl無顯著性差異。而NaCl質量濃度增加至60 g/L時，PC5的OD600nm顯著下降至0.62，但仍然具有一定程度的耐受性，當NaCl質量濃度增加至80 g/L及以上時，菌株PC5幾乎不能生長。由此可得菌株PC5對ρ(NaCl)≤60 g/L有較好的耐受性。

圖8 菌株PC5在不同質量濃度NaCl中的生長Fig.8 The growth of strain PC5 in different mass concentrations of NaCl

3 結論與討論

乳酸菌在傳統泡菜發酵過程中占主導地位，因此泡菜中有豐富的乳酸菌資源[20]。在泡菜發酵過程中，雜菌生長會將蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而接種乳酸菌發酵泡菜能迅速降低發酵泡菜的pH值，即抑制雜菌生長以及硝酸鹽的轉化，促進亞硝酸鹽的降解，因此篩選產酸能力和降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌有利于接種發酵泡菜的研究[21]。

在本研究中，從陜西家庭自制泡菜中分離出了1株植物乳桿菌PC5，它具有較強的降解亞硝酸鹽能力，在含有150 mg/L NaNO2的培養基中發酵24 h能將pH值降低至3.74±0.01，同時亞硝酸鹽降解率達到(99.37±0.56)%。在發酵8 h時，菌株PC5的亞硝酸鹽降解率達到(49.46±3.65)%，推測菌株PC5可能存在酶降解與酸降解2種亞硝酸鹽降解方式。

泡菜中添加的食鹽以及產生的亞硝酸鹽都會對乳酸菌的生長產生威脅，因此接種發酵泡菜的乳酸菌需要對食鹽與亞硝酸鹽具備一定耐受能力。菌株PC5在含有0～40 g/L NaCl的環境條件下生長良好，對60 g/L NaCl具有較好耐受能力。對0～200 mg/L NaNO2，菌株PC5具有較好的耐受性，OD600nm能達到0.5以上。菌株PC5生長延滯期短，產酸快且降解亞硝酸鹽能力強，同時具有較好的亞硝酸鹽和NaCl耐受能力，在提升泡菜品質與安全性方面有較大應用潛力，為開發益生菌制劑提供基礎。