高效液相色譜法測定略陽烏雞肌肉中的肌苷酸

陳怡博，劉媛，陳銳*，曹蕓花，韓豪

1(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723000)2(西安市閻良區(qū)市場監(jiān)督管理局，陜西 西安，710089)

略陽烏雞又叫黑河烏雞，是陜西漢中地區(qū)略陽縣的一個獨立烏雞品種。在全國四大烏雞中，略陽烏雞體形最大、雞肉細(xì)嫩、味醇香、營養(yǎng)豐富，烏皮、烏腿、烏趾、烏喙、烏舌、烏冠的“六端烏”特征，是在當(dāng)?shù)鬲毺氐牡乩憝h(huán)境條件下經(jīng)人們長期馴化和半野生放養(yǎng)形成的一種古老的優(yōu)良地方肉用型雞種[1-2]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，生肉中前體物質(zhì)綜合呈現(xiàn)出既咸又腥的滋味，當(dāng)給予加熱、烘烤等一定的條件時，這些物質(zhì)會產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)達(dá)到平衡時生成新的呈味物質(zhì)，賦予肉香味，也就是風(fēng)味[3-5]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對于如何提高畜禽肉質(zhì)風(fēng)味做了大量的實驗研究，在眾多禽畜肉質(zhì)風(fēng)味的評價指標(biāo)中，肌苷酸是研究者們公認(rèn)的禽畜肉質(zhì)鮮味最重要的表達(dá)及檢測物質(zhì)[6-10]。

紙電泳法、紫外吸收相結(jié)合法、薄層層析法是早期研究者們測定肌苷酸所使用的主要方法[11-13]。目前，具有高效、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜法已廣泛用于肌苷酸的檢測分析[14-16]。本實驗選用高效液相色譜法測定略陽烏雞肌肉肌苷酸含量，選取4種樣品前處理方法，探索肌肉中肌苷酸的提取效率。通過實驗得到最佳的高效液相色譜條件，建立了略陽烏雞肌肉肌苷酸準(zhǔn)確度與靈敏性高的檢測方法，為其方法學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

略陽烏雞，陜西百味園網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；三乙胺(色譜純)，麥克林公司；甲醇(色譜純)，Merck公司；H3PO4(色譜純)、KH2PO4、四丁基硫酸氫銨，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；肌苷酸標(biāo)品(純度≥99.9%)，北京中科儀友化工技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀，戴安公司；AP-OIP真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PHS-3C pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SB-100DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-80-2B低速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取新鮮屠宰的略陽烏雞腿部肌肉樣100 g，用剪刀剪碎，每次取樣均為5 g，平行3組。

鮮肉樣品：取樣后加入10 mL 0.05 mol/L磷酸三乙胺(0.05 mol/L磷酸三乙胺：精確量取7 mL H3PO4，加入200 mL超純水和14.4 mL三乙胺，搖勻后加入超純水定容至1 000 mL，用三乙胺調(diào)pH=6.5，0.45 μm水系膜過濾，超聲脫氣30 min)，打磨至勻漿狀，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，提取上清液，重復(fù)3次，用0.05 mol/L磷酸三乙胺定容至50 mL 容量瓶中，超聲提取30 min，待測。

鮮肉去脂樣：取樣勻漿后，振蕩搖勻，用55 ℃恒溫水浴1 h，靜置30 min，濾掉上清液，收集肉糜，重復(fù)3次；離心提取上清液，重復(fù)3次，定容至50 mL容量瓶中超聲提取30 min，待測。

冷凍干燥樣：取樣置于干凈的培養(yǎng)皿中，放于冷凍干燥機中48 h，取出后按制鮮肉方法制樣。

冷凍干燥去脂樣：取樣冷凍干燥后加入等體積的石油醚去脂制樣。

1.3.2 色譜條件

1.3.2.1 色譜柱的選擇

甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；檢測波長248 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min。進樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱對分離效果的影響。

1.3.2.2 檢測波長的選擇

選定色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,Φ5 μm)；流動相：甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min。進樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察248、254、270 nm波長條件下的檢測結(jié)果。

1.3.2.3 流動相的選擇

選定色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測波長248 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min。進樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)、甲醇-磷酸三乙胺(體積比5∶95)、甲醇-磷酸三乙胺(體積比3∶97)和磷酸鹽緩沖液(準(zhǔn)確稱取1.360 g磷酸二氫鉀和0.475 3 g四丁基硫酸氫銨，加900 mL超純水，調(diào)pH=3.33，定容至1 000 mL，0.45 μm水系膜過濾，超聲脫氣30 min)-甲醇(體積比4∶96)的流動相體系。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 線性考察

準(zhǔn)確稱取肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品6.10 mg，用流動相定容到25 mL容量瓶中，濃度為244 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別在母液中吸取0.5、1、2、3、4 mL 溶液，用流動相定容至10 mL，濃度分別為12.2、24.4、48.8、73.2、97.6 μg/mL，配成肌苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

將上述系列標(biāo)準(zhǔn)工作液在選定的色譜條件下進樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，在Excel中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.3.2 精密度考察

以24.4、97.6、244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為低中高3個測定濃度，在選定的色譜條件下分別連續(xù)進樣6針，測定肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的精密度。

1.3.3.3 重現(xiàn)性考察

取同一樣品6份，每份5 g，按1.3.1的方法制備樣品溶液，在選定的色譜條件下進樣測定，計算含量，確定重復(fù)性。

1.3.3.4 穩(wěn)定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置1、2、4、8、12、24、48 h，在選定的色譜條件下進樣測定，計算含量，疊加信號值確定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值，進而確定穩(wěn)定性。

1.3.3.5 檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度為244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，在選定的色譜條件下進樣測定，以S/N的10倍和3倍確定其檢出限和定量限。

1.3.3.6 加標(biāo)回收率考察

稱取5 g肌肉樣品3份，分別加入質(zhì)量濃度為12.2 μg/mL的肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按1.3.1的方法制備樣品溶液，稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍內(nèi)，在選定的色譜條件下進樣測定，根據(jù)加標(biāo)前后樣品中肌苷酸濃度和加標(biāo)量，回收率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，加標(biāo)試樣測定值;B，試樣測定值;C，加標(biāo)量。

1.3.4 四種前處理樣品肌苷酸含量的測定

樣品肌苷酸含量的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：m,樣品的肌苷酸含量，g/kg；X,與標(biāo)曲相對應(yīng)的樣品肌苷酸的濃度，μg/mL；V,樣品液的總體積，mL；Y,所稱取樣品的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

由圖1可以看出，COSMOSIL Packed Column C18色譜柱的分離效果最佳。因此本次實驗選取COSMOSIL Packed Column C18色譜柱進行測定分析。

A-AcclaimTM120 C18柱子;B-COSMOSIL Packed Column C18柱子圖1 不同色譜柱下肌苷酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of inosinic acid under different chromatographic columns

2.1.2 檢測波長的選擇

由表1可知，3個波長條件下保留時間相同，在248 nm下的峰面積大，響應(yīng)值高，定量檢測會越準(zhǔn)確，因此本次實驗選取248 nm進行測定。

表1 不同波長條件下的檢測結(jié)果Table 1 Detection results under different wavelength conditions

2.1.3 流動相的選擇

甲醇-磷酸三乙胺和甲醇-磷酸鹽緩沖液兩種流動相，以相同的體積比(4∶96)和色譜條件進樣后，得到的色譜圖(圖2)。由圖2可知，A圖峰形和檢測效果較差，可見肌苷酸在磷酸鹽緩沖液-甲醇體系中穩(wěn)定性較差。

選擇甲醇-磷酸三乙胺流動相之后，對其體積比進行考察。由表2可知，在甲醇-磷酸三乙胺體積比為4∶96條件下主要的定量指標(biāo)峰面積最大，適合檢測分析。因此最終選擇甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)為流動相進行本次實驗。

A-磷酸鹽緩沖液-甲醇;B-甲醇-磷酸三乙胺圖2 不同流動相下肌苷酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of inosinic acid in different mobile phases

表2 不同流動相條件下的檢測結(jié)果Table 2 Test results of different mobile phase conditions

2.1.4 色譜條件的確定

根據(jù)以上數(shù)據(jù)結(jié)果分析，本次實驗最佳的色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；檢測波長：248 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min。樣品梯度洗脫如表3所示。

表3 樣品梯度洗脫結(jié)果Table 3 Gradient elution results of samples

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性考察

在2.1.4的色譜條件下以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7 152x-1 330，R2=0.999 9，線性范圍12.2～97.6 μg/mL，肌苷酸在該范圍線性良好。

2.2.2 精密度考察

如表4所示，是在肌苷酸濃度分別為24.4、97.6、244 μg/mL連續(xù)進樣6針的結(jié)果，3個濃度下的RSD<5%，精密度良好，均滿足試驗方法的測定要求，且中濃度的RSD值最小，準(zhǔn)確性最高。

表4 不同肌苷酸濃度精密度比較(n=6)Table 4 Comparison of precision of different inosinic acid concentrations(n=6)

2.2.3 重現(xiàn)性考察

如表5所示，通過疊加峰信號值得到峰面積RSD，依次通過1.3.6中公式計算樣品中肌苷酸的含量，得出RSD為8.58%，說明該實驗方法在鮮肉去脂樣的測定中具有良好的重現(xiàn)性。

表5 重現(xiàn)性考察結(jié)果Table 5 Results of reproducibility investigation

2.2.4 穩(wěn)定性考察

同一份肌肉樣品在常溫下放置7個時間段，分別測定其肌苷酸含量，結(jié)果如表6所示，在12 h內(nèi)的RSD為3.09%，因此所制得的樣品應(yīng)在12 h內(nèi)完成測定，以保證試驗的準(zhǔn)確度。

表6 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 Results of stability investigation

2.2.5 檢出限和定量限

在2.1.4所確定的最佳色譜條件下對依次稀釋的母液標(biāo)準(zhǔn)品進樣測定，最終測得S/N=10時標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度約為0.08 μg/mL，S/N=3時標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL，在這2個濃度條件下進樣第2針未出峰，說明已達(dá)檢測限。

2.2.6 加標(biāo)回收率考察

表7為3份鮮肉去脂樣品的加標(biāo)回收率系列測定值，平均回收率99%，RSD值為2.71%，說明本次實驗的方法準(zhǔn)確性高。

表7 加標(biāo)回收率考察結(jié)果Table 7 Investigation results of spiked recovery rate

2.3 四種方法處理后的肌肉樣品肌苷酸的測定結(jié)果

按照1.3.4的含量計算公式和2.1.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算鮮肉樣品肌苷酸的含量。

樣品色譜圖如圖3所示。圖3-A為鮮肉樣品得到色譜圖，峰面積為8 788 mAu/min，算得樣品的含量為0.014 g/kg；圖3-B為冷凍干燥樣樣品得到色譜圖，峰面積為15 438 mAu/min，計算得樣品的含量為0.018 g/kg；圖3-C為鮮肉去脂樣樣品得到色譜圖，峰面積為11 592 mAu/min，計算得樣品的含量為0.023 g/kg；圖3-D為冷凍干燥去脂樣品的色譜圖，峰面積為19 647 mAu/min，計算得樣品的含量為0.029 g/kg，所得結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

3.1 色譜方法的優(yōu)化和驗證

本次實驗改進了高效液相色譜法測定略陽烏雞肌肉肌苷酸的主要測定條件。采用DIONEX UltiMate3000高效液相色譜儀，依次控制色譜柱、檢測波長、流動相體系和流動相比例，進樣標(biāo)準(zhǔn)品，通過對檢測結(jié)果的分析最終確定了最佳的測定條件:COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)為流動相，柱溫25 ℃, 檢測波長248 nm,進樣量20 μL。方法的檢測限分別為0.02、0.08 μg/mL，方法精密度RSD值在0.30%～4.78%；平均回收率99%，RSD值為2.71%；肌苷酸方程線性范圍為12.2～97.6 μg/mL，R2=0.999 9，線性關(guān)系均良好。

A-鮮肉樣品;B-冷凍干燥樣色譜圖;C-鮮肉去脂樣色譜圖;D-冷凍干燥去脂樣色譜圖圖3 樣品色譜圖Fig.3 Sample chromatogram

3.2 樣品處理方法的分析

運用HPLC檢測分析時，樣品的提取率是最重要的影響因素之一。充分考慮溶劑性質(zhì)、溶液選擇、pH、溫度、樣本處理方式等內(nèi)外因素來提升提取效率和檢測的準(zhǔn)確性。因為新鮮雞肉中含有大量的脂肪，肌苷酸是屬于水溶性化合物，根據(jù)相似相容原理，如果不脫除脂肪，其提取率就會降低。因此實驗選擇脫除肌肉脂肪來前處理樣品，如圖3所示，脫除脂肪的肌肉樣品中肌苷酸的含量比較高，得到了理想的實驗結(jié)果。

3.3 未知峰的分析

王美玲[17]報道了肌苷酸、鳥苷酸均為嘌呤合成的關(guān)鍵代謝物質(zhì)。肌苷酸為合成鳥苷酸的中間物質(zhì)，谷氨酰胺和PRPP經(jīng)不同的酶催化轉(zhuǎn)化為肌苷酸，再被相應(yīng)的酶催化為鳥苷酸。在另一轉(zhuǎn)化途徑中, 肌苷酸在肌苷酸脫氫酶和鳥苷酸合成酶的作用下生成鳥苷酸[18]。5′-鳥苷酸和5′-肌苷酸是自然界中存在的2種單核苷酸，均具有強烈的呈味作用，在不同的pH、溫度條件下含量表現(xiàn)出差異性[19]。在接近中性條件下，鳥苷酸的溶解性大于肌苷酸；中性pH下熱穩(wěn)定性二者的殘留率均大于90%，穩(wěn)定性較好[20-21]。本次實驗所使用流動相的pH值為6.5，偏中性，實驗結(jié)果與上述研究報道相契合。從結(jié)構(gòu)上看，肌苷酸和鳥苷酸結(jié)構(gòu)極為相似，二者結(jié)構(gòu)相差一個—NH2，鳥苷酸比肌苷酸極性大，極性大的物質(zhì)出峰時間早，與圖3吻合，由此可推測未知峰的物質(zhì)為鳥苷酸，有待后續(xù)實驗的驗證。