熱處理中芡實黃酮對肌原纖維蛋白結構的影響

賀文杰，吳彬彬，胥 偉,*，王宏勛，易 陽，雷飛飛

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；3.湖北小胡鴨食品有限責任公司，湖北 荊州 434000）

肌原纖維蛋白是肉重要組成成分，其主要功能是維持肌肉伸展和收縮，用于維持肉類鹵制品的感官品質。但是在高溫條件下，肌纖維極易由于肌原纖維蛋白變性而碎片化，鹵制品感官品質會因此劣變顯著[1-3]。針對此類問題，已有研究表明，部分功能性植物中黃酮類化合物能明顯抑制熟肉制品中肌原纖維蛋白氧化降解從而達到改善感官品質目的，還有部分體外實驗表明，大豆中黃酮類化合物能通過抑制氨基酸側鏈羰基結構的生成從而抑制牛肉制品的氧化劣變[4-6]，但是熱處理條件下黃酮類物質對肌原纖維蛋白結構影響機理仍未具體闡明。

由于芡實黃酮種類豐富且含量大，以及較多的黃酮醇羥基有助于芡實黃酮與蛋白質的結合[7]，本實驗將芡實黃酮作為外源植物活性物質與肌原纖維蛋白結合，并通過在90 ℃條件下對結合不同質量芡實黃酮的肌原纖維蛋白結構進行分子熒光測定、近紅外光譜分析以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析測定，探析熱處理中芡實黃酮對鴨腿肌原纖維蛋白結構的影響機理，進而解釋不同芡實黃酮與肌原纖維蛋白質的質量比條件下的鹵味鴨腿感官品質變化規律，以期為芡實在鴨肉鹵制加工中的應用提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白（純度≥98%） 德國BioFroxx有限公司；乙醇（食用級）、乙酸乙酯、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、考馬斯亮藍、氯化鎂、乙二胺四乙酸、氯化鈉、氯化鉀、乙二酸四乙酸二鈉、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、β-巰基乙醇等有機試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

F-7000型熒光分光光度計、N-500近紅外光譜儀日本日立公司；Evolation 300型紫外-可見分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司；TGL16M冷凍離心機上海安亭科學儀器廠；FA2004B分析天平、STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16WS超速離心機 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 金壇區白塔新寶儀器廠；UVS-1旋渦振蕩器 常州國華電器有限公司；FD-1冷凍干燥機、JK-2200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；YB-1000A型高速磨粉機 浙江省永康市速峰工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨腿肌原纖維蛋白制備

參考Huang Feng等[8]的方法并略有改動。鴨腿用生理鹽水洗去表面殘血，用濾紙吸干后切碎，取2 g肉樣加入20 mL緩沖液（150 mmol/L氯化鈉、25 mmol/L氯化鉀、3 mmol/L氯化鎂、4 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和1 mmol/L蛋白酶抑制劑（PMSF），pH 6.5），1 000 r/min勻漿30 s，然后4 ℃、5 000 r/min離心30 min，含有肌原纖維蛋白沉淀物的樣液用緩沖液（50 mmol/L氯化鉀、5 mmol/Lβ-巰基乙醇）沖洗3 遍，重復上述勻漿和離心過程，最后再用此溶液提取沉淀，勻漿，最終得到懸濁液即為肌原纖維蛋白提取液，蛋白濃度用雙縮脲法測定，本研究中肌原纖維蛋白質量濃度為1.00 mg/mL。

1.3.2 芡實黃酮制備及測定

參考Arief等[9]的方法并略有改動。選取50 g芡實放入托盤中，置于鼓風干燥箱于65 ℃干燥8 h后，取出冷卻，使用高速粉碎機粉碎3 min，連續粉碎2 次后過60 目篩得芡實粉末，放入密封袋貯藏備用。芡實粉末稱取50 g（料液比1∶12（g/mL））于1 000 mL燒杯中，加入600 mL 60%的食用乙醇溶液，保鮮膜密封后開小孔，60 ℃超聲提取2 h后，取出靜置10 min分層，減壓過濾，50 ℃旋轉蒸發濃縮定容至500 mL容量瓶中，得到芡實提取液，將提取液預凍12 h，用冷凍干燥機凍干24 h，所得粉末即為芡實黃酮類物質。

由于芡實黃酮的基本結構是苯環A-取代基B-苯環C環2 個共軛體系與蘆丁結構相似，本研究根據蘆丁標準曲線測定芡實總黃酮含量，其中，蘆丁標準曲線為y=0.102x-0.022，R2=0.969 7，本研究選取的芡實黃酮質量濃度為1.25 mg/mL。

1.3.3 鹵味鴨腿感官評價

參考高雪琴等[10]的方法并略有改動。將在不同芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比（1∶9、1∶4、3∶7、2∶3）以及未添加芡實條件下制得的鹵味鴨腿由感官評定小組（由5 位有經驗的同學組成）進行感官評定，其中，未添加芡實黃酮條件下制得的鹵味鴨腿記作空白組，評定標準設置為百分制，見表1。

表 1 鹵味鴨腿感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of marinated duck thigh meat

1.3.4 分子熒光測定

參考Turgut等[11]的方法并略有改動。制備芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比分別為1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，以不添加芡實黃酮的肌原纖維蛋白溶液為空白組樣液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min分別從最終配制好的混合溶液以及空白組樣液中取2 mL進行熒光掃描。熒光掃描條件：固定激發波長296 nm，發射波長270～350 nm，激發、發射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速率12 000 nm/min。

從空白組樣液和芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4的混合液中各取3 mL，分別測定三維熒光圖譜。測定條件：激發波長200～800 nm（采樣間隔2 nm），發射波長200～800 nm（采樣間隔2 nm），掃描時間間隔為15 min。

1.3.5 傅里葉變換紅外吸收光譜分析

參考Nguyen等[12]的方法并略有改動。制備芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比分別為1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min將混合液在500～4 500 cm-1范圍內進行紅外光譜測定，信號采集模式為衰減全反射模式。在相同條件下測定未添加芡實黃酮的肌原纖維蛋白溶液的紅外光譜作空白組。

1.3.6 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

參考Sante-Lhoutellier等[13]的方法并略有改動。分離膠和濃縮膠濃度分別為12.50%和4.00%。制備芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比分別為1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，以未添加芡實黃酮的肌原纖維蛋白作為空白組樣液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min后將混合液與空白組樣液均按4∶1的比例與上樣緩沖液進行混合。金屬浴90 ℃加熱5 min，取10 μL最終混合液進行凝膠電泳分析。

1.4 數據處理

實驗數據經SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，采用Peakfit對近紅外光譜數據進行擬合，使用Origin 8.5軟件以及Excel軟件分別進行繪圖和制表。

2 結果與分析

2.1 芡實黃酮與肌原纖維蛋白結合機制

由圖1可知，熱處理過程中，芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液的1/c（c為芡實黃酮質量濃度）（8.75、12.47、17.60、35.00（g/L）-1）與相對應的ΔFmax/ΔF（1.26、1.50、2.00、3.25）均滿足Benesi-Hildebrand方程ΔFmax/ΔF=1+1/c。Chowdhury等[14]也發現高溫條件下黃酮類化合物與牛血紅蛋白結合機制滿足Benesi-Hildebrand方程，且結合常數為2.0×103（mol/L）-1。因此，本實驗選取芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶9、1∶4、3∶7、2∶3，并在此條件基礎上進行研究。

圖 1 肌纖維蛋白和芡實黃酮結合的Benesi-Hildebrand圖Fig. 1 Benesi-Hildebrand plot for binding between myofibrillar proteins and gordon euryale flavonoids

2.2 熱處理對芡實黃酮含量的影響

表 2 加熱時間對芡實黃酮含量的影響Table 2 Influence of heating time on flavonoid content of gordon euryale seeds

為了進一步驗證熱處理中芡實黃酮的生物功效，將質量濃度為1.25 mg/mL芡實黃酮溶液在90 ℃條件下進行水浴加熱，加熱時間定為45 min，且每隔15 min測定芡實黃酮含量。由表2可知，熱處理15、30、45 min的芡實黃酮質量濃度分別為1.20、1.05 mg/mL和1.04 mg/mL，這與黃惠華等[15]發現在95 ℃熱處理條件下大豆異黃酮含量變化情況相似。結果表明，熱處理30、45 min的芡實黃酮含量變化并不顯著。這一發現驗證了熱處理條件下蛋白質二級結構的差異主要是由芡實黃酮初始添加量變化所致。

2.3 芡實黃酮對鹵味鴨腿感官品質的影響

圖 2 芡實黃酮與蛋白質質量比對鴨肉鹵制品感官品質的影響Fig. 2 Effect of mass ratio of flavonoids to myofibrillar proteins on the sensory quality of marinated duck meat

由圖2可知，鹵味鴨腿感官評分隨芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比增大呈先增后減的趨勢，相較于空白組的鹵味鴨腿，在質量比為1∶9條件下的鹵味鴨腿感官評分最高（85），這與江云濤[16]發現芡實添加量對餅干感官品質的影響結果相似。結果表明，鹵味鴨腿感官品質與芡實黃酮添加量不呈正相關，因此，本實驗將通過研究熱處理中芡實黃酮對肌原纖維蛋白結構的影響進而對這一變化規律進行解釋。

2.4 熒光光譜分析芡實黃酮對肌原纖維蛋白二級結構的影響

圖 3 不同加熱時間下肌原纖維蛋白和芡實黃酮-蛋白混合物的熒光曲線Fig. 3 Fluorescence spectra of myofibrillar protein-flavonoid mixtures at different heating times

由于肌原纖維蛋白中主要熒光物質為色氨酸和酪氨酸殘基，選取波長296 nm作為固定激發波長，在此波長下可認為肌原纖維蛋白中內源熒光來自色氨酸殘基[17]。如圖3所示，熱處理15、30、45 min的空白組肌原纖維蛋白在發射波長296 nm的熒光峰強度依次減少，分別為291、135、114；熱處理30、45 min的空白組肌原纖維蛋白在發射波長315 nm處的熒光強度分別由18增至28、43，其中，發射波長315 nm處的熒光物質為氨基酸氧化產物與其他物質反應生成物質。當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4且混合液熱處理30、45 min時，發射波長為315 nm熒光峰的熒光強度分別降至4、5，且遠低于空白組（28、43），同時發射波長為296 nm處熒光峰熒光強度分別降至41、5，此結果與朱穎等[18]利用熒光光譜分析得到熱處理中花青素對大豆蛋白氨酸殘基結構變化情況相似。

圖 4 肌原纖維蛋白（A）與肌原纖維蛋白結合黃酮（B）的三維熒光圖譜Fig. 4 Three-dimensional fluorescence spectra of myofibrilar proteins alone (A) and in combination with gordon euryale flavonoids (B)

為進一步對比熱處理條件下芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4的混合液和空白組樣液蛋白質二級結構差異，本研究對兩者進行三維熒光光譜分析，其中，根據色氨酸以及各類氨基酸熒光峰所對應波長大小，選取發射波長以及激發波長范圍為200～800 nm[19-21]。由圖4可知，當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4且混合液熱處理45 min時，蛋白質三維熒光區域λEx300～500 nm，λEx500～800 nm以及λEm550～800 nm，λEm250～450 nm區域面積縮減至空白組的1/3且更加分散，同時散射峰a、c的熒光強度降低，此結果與Lee等[22]利用三維熒光光譜分析結合泡菜提取物后肉中蛋白質二級結構變化情況相似。

綜上所述，當兩者質量比為1∶4時，芡實黃酮能通過分解肌原纖維蛋白表面水層進而與蛋白結合，由兩者結合所形成的不發光基態復合物能使蛋白質多肽鏈骨架以及蛋白質結構發生變化，進而一定程度上抑制色氨酸降解產物的進一步氧化，但與此同時，肌原纖維蛋白二級結構也開始發生明顯裂解，因此，僅管鹵味鴨腿中由氨基酸氧化造成的異味有一定程度減少但整體感官品質仍低于最佳狀態。同時，由于目前國內鹵制品加工仍存在落后產能過剩以及標準化程度低等問題，大多食品企業開始采用外源植物提取液代替固體外源植物添加物進行鹵制[23]。根據胡愛軍[24]和姜國慶[25]等發現的鴨肉中總蛋白含量占比15.50%，總蛋白中肌原纖維蛋白含量占比50%～55%，其次，本實驗中芡實提取液冷凍干燥前后質量比為100∶1（g/g）以及芡實提取液制備中芡實與食用乙醇料液比為1∶12（g/mL），可以得知在芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4條件下，鹵制1 000 g鴨腿大致需要2 000 mL芡實提取液，其中，芡實提取液制備需使用167 g芡實，因此，此條件雖然可以使鹵味鴨腿感官品質在空白組基礎上有一定程度提升，但是也明顯增加了工業成本。

2.5 傅里葉變換近紅外光譜分析

圖 5 不同加熱時間和芡實黃酮添加量的肌原纖維蛋白近紅外峰擬合曲線Fig. 5 Near infrared peak fitting curves of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

表 3 非結合型和結合型芡實黃酮肌纖維蛋白近紅外光譜參數Table 3 Secondary structure composition of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

選取紅外光譜的酰胺I帶分析肌原纖維蛋白的二級結構組成，采用Peakfit軟件對蛋白質酰胺I帶進行解析，首先對所得紅外光譜的酰胺I帶進行傅里葉去卷積處理，控制半峰寬為5 cm-1，增強因子為1.0。結合原始圖譜（圖5）和去卷積譜得到的子峰峰位，進行相應二級結構構象指認。其中，各峰位的歸屬指認依據：β-折疊結構，1 637、1 615、1 695 cm-1；β-折疊或β-轉角結構，1 684 cm-1；β-轉角結構，1 670 cm-1；α-螺旋結構，1 640 cm-1；無規卷曲結構，1 649 cm-1。

如表3所示，肌原纖維蛋白主要結構為β-折疊，混合液熱處理45 min后，空白組中α-螺旋占比由16.85%降至8.56%、β-折疊占比由44.95%增至51.03%、β-轉角占比由9.79%增至11.76%、無規卷曲結構占比由28.41%增至28.65%。當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶9且混合液熱處理30 min時，β-轉角占比降至最低（12.24%），且遠低于空白組（25.72%），此結果與Serson[26]和Carbas[27]等利用近紅外光譜分析所得熱處理中大豆蛋白、丹參蛋白二級結構變化情況相似。結果表明，熱處理使蛋白質中α-螺旋結構轉變為β-折疊進而轉變為β-轉角和無規卷曲結構，芡實黃酮能通過降低蛋白質無規卷曲結構占比以及β-轉角的占比進而維持蛋白質二級結構整體穩定，同時，相較于其他條件下制得的鹵味鴨腿，當混合液中芡實黃酮與肌原纖維蛋白的質量比為1∶9時，蛋白與呈味物質的結合位點由于β-轉角和無規卷曲結構占比減少以及蛋白質聚集程度降低而大量暴露，因此，此時鹵味鴨腿整體香味較好且整體感官品質最佳。

2.6 肌原纖維蛋白SDS-PAGE結果

圖 6 不同芡實黃酮添加量和加熱時間的肌原纖維蛋白電泳圖Fig. 6 SDS electrophoretograms of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

由圖6可知，空白組中肌原纖維蛋白隨著熱處理時間延長，肌球蛋白重鏈、α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白T+以及肌球蛋白輕鏈I都發生嚴重降解。相較于空白組，當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶9且混合液熱處理30 min時，這幾類蛋白組分的條帶最為清晰，此時芡實黃酮的生物功效最為顯著，然而當混合液中芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶4、3∶7、2∶3時，熱處理中這幾類蛋白組分降解程度均明顯增大，且混合液熱處理45 min后，僅存一條較淺肌球蛋白輕鏈II條帶，此結果與Shin[28]、Carlsen[29]和Bandyopadhyay[30]等利用SDS-PAGE分析加工過程中牛背肌肌原纖維蛋白、豬肉中肌原纖維蛋白以及天然植物蛋白降解情況相似。結果表明，熱處理使肌原纖維蛋白內部蛋白組分嚴重降解，芡實黃酮能通過維持熱處理中肌原纖維蛋白內部蛋白組分結構完整進而穩定肌原纖維蛋白結構，同時相較于其他條件下鹵味鴨腿，當混合液中芡實黃酮與肌原纖維蛋白的質量比為1∶9時，α-輔肌動蛋白和肌鈣蛋白T+的降解程度最小，由于α-輔肌動蛋白和肌鈣蛋白T+的降解程度是肌纖維Z線、肌纖維I帶重要組成部分，此條件下鹵味鴨腿的滋味和組織狀態較好且整體感官品質最佳。

3 結 論

本研究通過研究熱處理中芡實黃酮對肌原纖維蛋白二級結構的影響進而分析鹵味鴨腿感官品質關于芡實添加量的變化規律，得到結論如下：

當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比為1∶9時，鹵味鴨腿感官品質最佳，這主要是因為芡實黃酮通過降低蛋白中氨基酸次級氧化產物含量、β-折疊和無規卷曲結構占比，進而增加了蛋白質與呈味物質結合位點以及通過維持肌纖維Z線、肌纖維I帶的完整，進而提升了鹵味鴨腿滋味及組織狀態。

當芡實黃酮與肌原纖維蛋白質量比分別為1∶4、3∶7、2∶3時，鹵味鴨腿感官品質逐漸下降，這主要是因為過高的芡實黃酮添加量使肌原纖維蛋白二級結構裂解明顯，且導致肌原纖維蛋白內部蛋白組分在熱處理過程中氧化降解，并最終造成了鹵味鴨腿組織狀態以及風味劣變。

這一發現可以為鹵制品加工行業開發新型的天然抗氧化劑來源以及為后續芡實在肉品加工中的應用提供一定的理論支撐。