輔助蛋白基因的剪接對磷脂酶A1酶活的影響

楊 蒙，薛正蓮,2,*，甘玉飛，周 杰，王 洲,2，劉 艷,2

（1.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

磷脂酶A1（phospholipase A1，PlaA1）在食品、醫療、紡織等行業用途十分廣泛，其主要用途為植物的油脂脫膠[1]。PlaA1將植物粗油中存在的磷脂雜質進行酶解，生成游離脂肪酸和親水性溶血磷脂，以提高后期油脂存儲的穩定性[2]。目前，關于PlaA1的研究，主要集中于對其本身進行分子改造[3-7]和發酵工藝條件優化[8]以提高PlaA1的催化活性。Jae[9]、Fu Jianhong[10]和蘇燕南[11]等從沙雷氏菌中發現編碼PlaA1的基因下游存在一段與plaA1基因重疊5 bp的輔助蛋白基因plaS，該基因能編碼蛋白質但無酶活性，將PlaA1與磷脂酶A1輔助蛋白（phospholipase A1 accessory protein，PlaS）共表達基因plaB克隆在大腸桿菌中發現，胞外會產生有活性的PlaA1，但是單獨表達PlaA1時會產生大量沒有PlaA1活性的包涵體，表明plaS對PlaA1的胞外表達具有調控作用。

對PlaS進行生物信息學分析發現，PlaS屬于錨蛋白（Ankyrin，ANK）家族中的ANK2家族，根據GenBank（Protein-ID：AFN44705.1）數據分析，其蛋白結構是由N端、ANK區域和C端三部分區域組成，其中ANK區域包含4 個典型的ANK重復序列（ANK reapeat）。ANK是一種胞內連接蛋白，為單鏈多肽，通常由若干個ANK repeat串聯而成，每一個ANK repeat包含30～33 個氨基酸，組成β2α2的“L”型結構[12]，可以介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用[13]。在許多生物體內的蛋白質中都發現了ANK repeat，其功能包括細胞信號轉導[14]、維持細胞骨架的完整性、調節細胞周期[15-16]、炎癥反應[17]、發育[18]和各種轉運作用[19-21]等。這些ANK repeat模塊通常形成一個由重復次數決定的形狀大小不同的細長表面。一個孤立的ANK repeat是無法行使其功能的，它必須與另一個ANK repeat相連接，其編碼的肽鏈才能產生正常的折疊[22]。也就是說ANK repeat串聯的個數對介導蛋白質與蛋白質相互作用影響較大。

基因剪接技術已經成為分子截短的重要研究手段。為了揭示PlaS對PlaA1的調控機制，朱昊等[23]將PlaS的N端區域的前35 個氨基酸截掉之后，與PlaA1進行共表達，發現其胞外酶活與未截短菌株相較有顯著增加，截短后的蛋白dPlaS的蛋白表達量也顯著增加。Zhang Bin等[24]曾對p16INK4分別進行了C端和N端的截短，其研究表明C端2 個重復序列可以自主形成折疊結構，而N端的2 個重復序列是孤立無序的，這表明這2 個區域在本質上具有不同的穩定性。

為進一步探究PlaS對PlaA1酶活的關鍵作用區域，本研究從PlaA1和PlaS共表達基因plaB的C端處開始剪接，并對截短菌株進行了胞外酶學性質研究，為后期闡明PlaS對PlaA1胞外酶活的調節機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

BP28工程菌，攜帶plaB基因（GenBank Accession No.JX138536.1），由本實驗室構建；plaB基因來源于黏質沙雷氏菌PL-06，其含有編碼PlaA1的基因plaA1與輔助蛋白基因plaS；BL21（DE3），JM109分別作為PlaA1及其截短基因的表達載體和克隆載體；選擇質粒pET-28a（+）作為基因載體。

磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養基

LB培養基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容到1 000 mL，調pH值至7.0。

PLB固體培養基：LB培養基84.5 mL，10%卵磷脂10 mL，0.01%溴甲酚紫3 mL，1 mol/L CaCl22.5 mL，瓊脂粉2 g；TB培養基：胰蛋白胨12 g，酵母粉24 g，磷酸二氫鉀2.31 g，磷酸氫二鉀9.85 g，3%甘油，蒸餾水定容到1 000 mL。以上培養基均在121 ℃，滅菌20 min，培養基中的卵磷脂、氯化鈣和溴甲酚紫需分開滅菌后混合使用。

乳糖自誘導培養基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，乳糖5 g，磷酸氫二鈉0.025 mol/L，磷酸二氫鈉0.025 mol/L，硫酸鎂1 mmol，甘氨酸7.5 g，葡萄糖0.8 g，蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

EL20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷凍高速離心機 賽默飛世爾公司；DYCP-31D水平電泳槽 北京六一儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；凝膠成像系統 美國Syngene公司；基因導入儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀 美國Bio-Rad公司；常壓室溫等離子體育種機 北京思清源物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 截短突變體的設計

將GenBank上公布的黏質沙雷氏菌PL-06 PlaA1輔助蛋白PlaS的氨基酸序列（Protein-ID：AFN44705.1）在NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行在線分析。根據輔助蛋白的氨基酸序列的分析結果，設計輔助蛋白截短突變體。

1.3.2 截短基因重組質粒的構建

本研究利用實驗室先前構建的一株產PlaA1工程菌BP28，在含δ50卡那霉素的LB液體培養基中培養工程菌BP28，于37 ℃搖床充分振蕩培養12～16 h。按照SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒進行制備質粒DNA樣品。

以pET-28a（+）-plaB質粒為模板，根據表1的引物，用Taq酶進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增34 個循環，條件如表2所示。對擴增后的片段進行膠回收，BamHI、HindIII雙酶切之后利用PCR純化試劑盒進行純化，純化后的樣品分別與pET-28a（+）載體連接，并轉化至BL21（DE3）感受態細胞中。在PLB平板中挑取陽性菌株送入南京金絲瑞公司進行測序驗證。

表 1 截短突變體引物設計Table 1 Primer sequences used for truncated mutants

表 2 截短突變體的PCR擴增條件Table 2 PCR amplification conditions of truncated mutants

1.3.3 胞外粗酶液的制備

分別從PLB平板上挑取陽性轉化子，接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min搖床過夜培養，活化后按1%接種量接入含有δ50卡那霉素的100 mL乳糖自誘導發酵培養基中，37 ℃、200 r/min培養8 h。將發酵終點后的發酵液于12 000 r/min、4 ℃離心2 min，上清液即為胞外粗酶液。由于各菌中的PlaA1蛋白表達量較低，表達水平無法計算，蛋白純化較為困難，因此后續采用胞外粗酶液進行酶學性質的研究。

1.3.4 截短菌株酶活測定

1.3.4.1 酶活測定

參考文獻[25]方法，PlaA1酶活力定義為：在45 ℃條件下，每分鐘水解卵磷脂產生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為一個酶活力單位（U）。比酶活定義為每毫克蛋白所含PlaA1的含量。蛋白含量的測定采用Bradford定量法，并繪制出蛋白標準曲線。將胞外酶液與考馬斯亮藍溶液反應后在595 nm波長處測得吸光度，根據蛋白標準曲線計算可得蛋白含量，再根據酶活大小，計算比酶活。

1.3.4.2 截短菌株透明圈的測定

將滅過菌的牙簽，分別蘸取各突變菌株于PLB平板上，將其放置37 ℃培養箱培養12～16 h，待長出單菌落，再將其放置4 ℃培養箱進行低溫培養3～4 d，可觀察到PLB平板上產生不同大小的透明圈，用游標卡尺測各菌落及其透明圈的直徑。

1.3.5 截短菌株酶學性質的研究

1.3.5.1 溫度對各截短菌株酶促反應的影響

根據PlaA1酶活測定方法，保持其他酶促反應條件不變，考察酶促反應溫度對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株PlaA1的最適溫度。以出發菌株BP28所產PlaA1在最適反應溫度下的酶活力定義為100%，計算其他樣品的相對酶活力。

將各截短菌株的PlaA1粗酶液置于最適溫度下進行水浴保溫處理，然后進行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經過保溫處理的酶活力定義為100%計算相對酶活力。

1.3.5.2 pH值對各截短菌株酶促反應的影響

酶活測定方法同1.3.4節，保持其他酶促反應條件不變，考察pH值對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株PlaA1的最適pH值。以出發菌株BP28所產PlaA1在最適反應pH值下的酶活力定義為100%，計算其他pH值的樣品相對酶活力。

將各截短菌株PlaA1粗酶液置于不同pH值下進行水浴保溫處理，然后迅速放置最適pH值下進行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經過酸堿處理的酶活力定義為100%計算相對酶活力。

1.3.5.3 動力學參數

以卵磷脂為底物，按照4%、6%、8%、10%的底物濃度，在pH 6、45 ℃條件下反應15 min，按照1.3.4節方法測定比酶活；反應速率V為比酶活與反應時間的比值，以反應速率和底物濃度S的倒數為坐標，根據Lineweaver-Burk作圖法分別計算Km和Vmax。

1.4 數據統計與圖標繪制

采用Excel軟件進行數據統計，Origin軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 截短突變體的設計

根據NCBI網站對PlaS進行BLAST在線比對的結果顯示，PlaS屬于ANK超家族，且含有4 個典型的ANK repeat，分別在PlaS氨基酸序列的46～76、78～109、111～142、145～176位置處。PlaS二級結構主要由α-螺旋、β-折疊以及無規卷曲組成，其中α-螺旋占比高達54.86%，無規卷曲占比達到34.24%。每一個ANK repeat都包含著2 個α-螺旋和2 個β-折疊，內部形成高度疏水區域。為探討PlaS對PlaA1酶活的關鍵調控區域，將其編碼基因進行截短，圖1為截短基因線性示意圖。

圖 1 plaA1與plaS截短基因的線性示意圖Fig. 1 Linear diagram of truncation of plaA1 and plaS

2.2 重組子的構建

以pET-28a-plaB質粒為模板，利用PCR技術對截短基因片段進行大量擴增，并將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠電泳條帶（圖2）表明，與截短目的基因相符。

圖 2 各截短基因的PCR電泳檢測圖Fig. 2 Electrophoresis patterns of PCR amplified truncated genes

從PLB平板上分別挑取陽性克隆子，接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min搖床過夜培養，按照SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒進行制備質粒DNA樣品。將陽性菌株送去南京金絲瑞公司進行測序，通過軟件DNAMAN進行序列比對，序列一致。將其分別進行保存，用于后續實驗。

2.3 各截短菌株胞外酶活的分析

為研究plaS的截短基因對PlaA1胞外酶活的影響，對各突變菌株所產透明圈進行圈徑比的計算。由于未截短菌株BP28與各截短突變菌株均含有plaA1基因，PlaA1可水解PLB平板上的大豆卵磷脂，在溴甲酚紫的作用下，可產生透明圈如圖3所示，圈徑比的大小表示各菌株胞外酶活的高低如表3所示。結合圖4各菌比酶活數據來看，當PlaS的C端區域缺失，ANK結構域保存3～4 個ANK repeat序列時，截短菌株AN-3與AN-4所產的PlaA1胞外比酶活分別為105.46 U/mg和108.16 U/mg，表現為胞外促進，達顯著水平（P＜0.05），與未截短菌株BP28 PlaA1胞外比酶活（60.88 U/mg）相比分別高了73%和78%。當ANK repeat的個數繼續減少時，PlaA1胞外比酶活開始顯著降低，截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1胞外比酶活分別為59.31、60.74 U/mg，當PlaS的ANK結構域完全缺失時，截短菌株AN PlaA1胞外比酶活為57.19 U/mg，與截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1的胞外比酶活并無顯著差異。同時各菌株的胞內比酶活表現出無顯著差異。從胞外比酶活的數據來看，在PlaS中ANK結構域至少需要3 個ANK reapeat串聯才會對PlaA1酶活表現為胞外促進作用。

圖 3 各截短菌株在PLB平板上的菌落圖Fig. 3 Colony morphology of each truncated strain on PLB plate

表 3 各截短菌株透明圈的圈徑值Table 3 Ratio of the diameter of the transparent circle to the diameter of each truncated strain

圖 4 各截短菌株在胞內與胞外的比酶活Fig. 4 Intracellular and extracellular specific enzymatic activity of each truncated strain

2.4 各截短菌株的酶學性質分析

2.4.1 溫度對各截短菌株PlaA1酶活的影響

圖 5 溫度對各截短菌株PlaA1活性與耐熱性的影響Fig. 5 Effect of temperature on the PlaA1 activity and heat resistance of each truncated strain

在最適溫度45 ℃條件下，以未截短菌株BP28的PlaA1酶活定義為100%計算相對酶活力，截短菌株AN、AN-1、AN-2、AN-3、AN-4的PlaA1相對酶活力分別為85.29%、84.80%、87.25%、110.29%、122.06%（圖5a）。結合圖5b可知，在45 ℃條件下，雖然突變菌AN-3、AN-4所產PlaA1的相對酶活力表現最高，但是其熱穩定性也表現最差，推測PlaS的C端部分可維持PlaA1的結構穩定性。當PlaS的ANK repeat被繼續截短時，AN、AN-1、AN-2所產PlaA1的相對酶活力有所下降，可能因為plaS的過度剪截在一定程度上破壞了輔助蛋白的結構。

2.4.2 pH值對各截短菌株PlaA1酶活的影響

如圖6a所示，截短菌株AN-3、AN-4所產生的PlaA1的最適pH值與BP28的相同，最適pH值均為6。而截短菌株AN、AN-1、AN-2的最適pH值發生了酸性偏移，最適pH值為5，說明輔助蛋白對PlaA1的酸堿性進行了一定程度的調控。由圖6b可知，當反應體系的pH 3～5時，各突變株的PlaA1活性呈現上升趨勢。各突變株在pH值在5～8的條件下均表現為較好的穩定性。

圖 6 pH值對各截短菌株PlaA1活性（a）及穩定性（b）的影響Fig. 6 Effect of pH on the PlaA1 activity (a) and stability (b) of each truncated strain

2.4.3 各截短菌株PlaA1酶促動力學參數的測定

圖 7 雙倒數法測定各截短菌株PlaA1的米氏常數Fig. 7 Lineweaver-Burk plot for Km determination of PlaA1 from each truncated strain

表 4 各截短菌株PlaA1的酶動力學方程Table 4 Enzymatic kinetic equation of PlaA1 from each truncated strain

表 5 各截短菌株PlaA1的酶動力學參數Table 5 Kinetic parameters of PlaA1 from each truncated strain

雙倒數法確定各截短菌株PlaA1的米氏常數及酶動力學見圖7、表4。根據所得到的各截短菌株的動力學參數（表5）來看，截短菌株AN-3與AN-4所產PlaA1的Km值與BP28的相比分別降低了1.37 倍和1.45 倍，催化效率（Kcat/Km）分別提高了216%和211%，表明PlaS的C端及ANK結構域一個ANK repeat被剪截后導致PlaA1空間構象發生改變，使得PlaA1與底物的親和力增強，表現出更高的催化效率和酶活力。同時可看出在所有的截短菌株中AN菌株酶的Kcat/Km最小，其催化效率最低，進一步表明ANK repeat的個數決定著ANK結構域的功能，對于調節PlaA1的胞外酶活起著重要作用。

3 討論與結論

通過生物信息學分析發現，PlaS屬于ANK2家族。在TMHMM網站中預測PlaA1和PlaS的跨膜結構圖中得到PlaA1是無跨膜螺旋結構的，而PlaS在其N端區7～27 aa有一個跨膜螺旋。PlaA1的胞外分泌可能是由于PlaS具有胞外運輸的功能。遺憾的是，PlaS與PlaA1獲得共表達時雖酶活較高，但是胞外蛋白表達量相對較低，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖上幾乎看不到PlaS條帶。朱昊[26]構建出PlaA1輔助蛋白N端截短菌株，得到了分離純化后N端截短的輔助蛋白dPlaS，將其與PlaA1分別進行了酵母雙雜交體內互作和Biacore體外互作實驗，驗證了兩者均存在相互作用，同時也發現N端截短之后的輔助蛋白PlaS可以在SDS-PAGE蛋白電泳圖上觀察到清晰的條帶。柏錫等[27]通過生物信息學的方法對大豆中GmANKTM家族受非生物脅迫的研究報告中提到ANKTM家族中含ANK基序和跨膜結構域，并對大豆中ANKTM家族中62 個基因進行了鑒定與分類，在ANKTM家族中蛋白含數量不等的ANK repeat，其對靶蛋白的結合能力也有所不同。由于ANK特殊的蛋白結構，在生物醫學研究中，ANK蛋白結合靶蛋白的特異性可設計成小型支架蛋白以起到靶向治療的作用[28-30]。目前人們對ANK在原核生物中的生理作用知之甚少，一些細菌的ANK蛋白在微生物的作用機制尚不明確。本實驗利用PCR技術對PlaS與PlaA1共表達基因plaB進行剪接，構建出一系列截短突變菌株，并分別測出各截短菌株胞外粗酶液的酶學性質，其中截短菌株AN-3與AN-4所產PlaA1酶活表現為胞外促進作用。實驗結果表明PlaS中的ANK結構域至少需要3 個ANK reapeat才會對PlaA1酶活表現為胞外促進作用，同時PlaS的C端域對于維持PlaA1的結構穩定性起到重要的作用。同時也說明了ANK reapeat的數目對于維持ANK結構域的功能發揮著關鍵性作用，為后期深入研究PlaS對促進PlaA1胞外分泌機理奠定了理論基礎。