基于9 種風味物質的利川紅SPME優化及PLS-DA風味識別

程 超，夏蘭欣，杜芬妮，李 偉，田 成

（1.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

香氣是評價和衡量茶葉品質的重要指標之一，同時也是指導消費者進行茶葉消費的重要導向之一[1]，紅茶中風味物質的種類和含量直接影響紅茶香氣和香型，因此紅茶風味成分與香氣品質的關系一直是茶葉科學的熱門研究領域，尤其是茶葉產地對風味的影響受到了日益廣泛的關注，發現不同地區、不同品種紅茶香氣具有特異性[2-3]。同種茶葉采用不同工藝，同一工藝利用不同原料加工而成的紅茶風味不同，因此紅茶風味與產地生態條件有很大關系，而風味物質可作為鑒別紅茶地理來源的指標[4]。

Owuor等[5]通過比較世界主要紅茶香氣組分發現，紅茶香氣成分的重要風味物質可分為兩組，第1組包括反-2-己烯醛、己醛、1-戊烯-3-醇、順-3-己烯醛、順-2-戊烯醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、戊醇、正己醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛等；而苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、芳樟醇及氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇及β-紫羅酮等能給紅茶帶來花香，為第2組化合物。

目前普遍認為氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術是最為簡便高效的分析鑒定茶葉風味物質的方法，但風味提取是最為關鍵的一步[6]。偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統計方法，該法可解釋樣品觀測數目少，減少變量間多重共線性產生的影響[7]。本法有利于對樣品不同產地[8-12]、不同加工方式[13-15]、不同質量品質[16-19]等的快速鑒別，此技術近幾年已經廣泛應用在代謝組學[20-22]和風味組學[23]的研究中。

湖北恩施州利川紅茶已有170多年加工歷史，1951年利川被國家列為宜紅工夫紅茶主產區，2017年利川紅被國家質量監督檢驗檢疫總局批準為國家地理標志保護產品，2018年擔任國賓用茶。近兩年利川紅發展迅速，但目前對利川紅風味物質的研究較少[24]，缺少有力的風味品質研究的基礎理論支撐，利川紅雖為宜紅主產區，但不同的地理位置賦予了利川紅特殊的風味品質，因此尚需深入研究。

本實驗結合Owuor理論首先確定利川紅中重要的風味物質，以此為基礎通過單因素試驗和Box-Behnken試驗優化其固相微萃取條件，同時對利川紅、宜紅、滇紅的風味進行對比分析，通過OPLS-DA進行風味預測，以期為利川紅風味品質提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利川紅：由利川市根之潤飲料公司提供，一芽二葉，小葉種；滇紅：購于恩施顏如玉茶葉公司，大葉種，一芽二葉；宜紅：購于恩施顏如玉茶葉公司，小葉種，一芽二葉；所有紅茶粉碎成粉末過80 目篩，備用。

正構烷烴（C8～C40）（色譜純，純度＞98.0%）美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉（分析純） 武漢市中天化工有限責任公司。

1.2 儀器與設備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動固相微萃取進樣器 美國Supelco公司；頂空瓶（15 mL） 德國IKA公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；HWS12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；6890-5973 GC-MS聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 料液比對利川產區紅茶風味物質的影響

首先將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在250 ℃老化2 h，至無干擾峰出現為止，備用，下同。稱取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專用頂空瓶中，分別按料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）加入60 ℃超純水，加入0.2 g NaCl，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上60 ℃水浴，插入已老化好萃取頭平衡10 min后推出纖維頭，萃取吸附50 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進樣口，250 ℃解吸3 min進樣測定，每個試驗重復3 次[25]。

1.3.2 萃取溫度對利川產區紅茶風味物質的影響

稱取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專用頂空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL超純水，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上水浴加熱，溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，插入已老化好的萃取頭平衡10 min后推出纖維頭萃取吸附50 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進樣口，250 ℃解吸3 min進樣測定，每個試驗重復3 次。

1.3.3 萃取時間對利川產區紅茶風味物質的影響

稱取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專用頂空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL 70 ℃超純水，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上70 ℃水浴，插入已老化好萃取頭平衡10 min后推出纖維頭，分別萃取吸附20、30、40、50、60、70 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進樣口，250 ℃解吸3 min進樣測定，每個試驗重復3 次。

1.3.4 Box-Behnken試驗組合設計優化萃取條件

選取萃取溫度、萃取時間和料液比3 個因素，利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1軟件，進行Box-Behnken試驗設計（表1）。

表 1 Box-Behnken試驗設計的因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 GC-MS檢測條件

GC條件[26]：DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min。程序升溫：起始溫度為40 ℃，保持5 min，隨后以3 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min，最后以15 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min。不分流進樣，進樣口溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV，質量掃描范圍35～450 u。

1.3.6 風味成分分析

GC-MS測定的各揮發性組分通過NIST05-Wiley標準譜庫進行檢索，在總離子流圖的色譜峰中挑選出匹配度不小于80，結合相對保留時間，查閱有關文獻數據進行定性，并根據香氣成分的峰面積值相對定量[27]。利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1軟件進行響應面分析。采用SIMCA 14.1軟件進行PLS-DA[28]，采用Origin 2018軟件進行熱圖分析。

1.3.7 萜烯指數和保留指數計算

萜烯指數和保留指數按下式[29-30]計算：

式中：n為正構烷烴碳原子數；tx、tn、tn+1分別為物質x和n、n+1碳原子數正構烷烴的保留時間/min。

2 結果與分析

2.1 利川紅茶固相微萃取條件優化

圖 1 利川紅茶風味物質固相微萃取的GC-MS總離子流圖Fig. 1 GC-MS total ion current chromatograms of aromatic components extracted from Lichuan Hong tea by SPME

如圖1所示，結合Owuor總結結果，選擇利川紅中匹配度不小于85的物質如2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物、香葉醇、水楊酸甲酯、檸檬醛9 種物質為利川紅的重要風味物質。茶葉香氣從基質遷移至消費者嗅覺器官除受茶葉本身內在因素影響外，發香條件如茶葉萃取溫度、萃取時間等貢獻也較大[30-31]。因此為了優化利川紅風味成分的固相微萃取條件，考察料液比、萃取溫度、萃取時間3 個影響因素，以上9 種風味物質的峰面積為評定指標。

2.1.1 利川紅固相微萃取的料液比優化

圖 2 料液比對利川紅9 種風味物質的影響Fig. 2 Influence of solid-to-liquid ratio on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由圖2可以看出，在60 ℃，9 種風味物質僅萃取了7 種，水楊酸甲酯和香葉醇并未萃取出來，7 種風味物質隨料液比減小峰面積不斷增加，尤其是2-己烯醛和順式芳樟醇氧化物顯著增加。順式芳樟醇氧化物具有花果香，而己烯醛呈現強烈青草氣，但稀釋后有清香的感覺，由此可見為使消費者品嘗的紅茶風味達到最好，不適宜使用過小料液比；同時料液比過大茶湯濃度過高，不能充分浸透茶葉，因此最佳料液比選擇1∶5（g/mL）。

2.1.2 利川紅萃取溫度優化

圖 3 萃取溫度對利川紅9 種風味物質的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由圖3可知，40 ℃時僅萃取了相對含量高的順式芳樟醇氧化物，隨溫度上升至50 ℃，苯乙醛、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇開始出現，60 ℃時除水楊酸甲酯和香葉醇外的7 種風味物質均被萃取，溫度70 ℃時9 種風味物質全部萃取，繼續升高溫度這些物質的萃取量有所下降，可能由于低溫分子熱運動不劇烈，風味物質揮發較慢；隨溫度升高，分子熱運動加劇，高沸點物質揮發，且揮發速度不斷增加。但過高溫度會使萃取頭固有成分解吸，降低吸附及解吸準確率。因此最佳萃取溫度選擇70 ℃。

2.1.3 利川紅萃取時間優化

圖 4 萃取時間對利川紅9 種風味物質的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

如圖4所示，當萃取時間為20 min時，水楊酸甲酯和香葉醇無法萃取出來，隨萃取時間延長，水楊酸甲酯、香葉醇和其他7 種風味物質的種類和峰面積均有所增加。綜合考慮最佳萃取時間選擇50 min。

2.1.4 Box-Behnken試驗結果

表 2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

以9 種重要風味物質總峰面積為響應值（表2），利用Design-Expert軟件可擬合出3 個影響因素的回歸方程：

峰面積=5.08×109+0.33×109A+0.47×109B+0.005×109C-0.99×109A2-0.76×109B2-1.09×109C2-0.27×109AB+0.33×109AC+0.31×109BC

通過Design-Expert軟件分析可得出，此方程R2=0.974 4，調整R2為94.14%，說明此方程可很好反映3 個影響因素對風味物質萃取的影響。利用Minitab 17.1軟件分析可得出紅茶的最佳萃取條件水平：A為0.107、B為0.350、C為0.029，即料液比1∶4.11（g/mL）、萃取溫度71.75 ℃、萃取時間50.15 min，此時9 種重要風味物質的峰面積為（5.172±0.075）×109，9 種風味物質均能萃取出來。

2.2 利川紅茶與宜昌、云南紅茶風味物質比較

2.2.1 3 種紅茶風味物質的GC-MS測定結果

表 3 3種紅茶風味物質的GC-MS成分鑒定Table 3 GC-MS analysis of aroma compounds in three black teas

續表3

續表3

由表3可以看出，3 種紅茶中共鑒定出124 種風味物質，宜紅、滇紅、利川紅鑒定的風味物質相對含量分別為92.807%、81.529%、83.166%。從風味物質化學結構看，宜紅、滇紅風味物質中醇類含量較高，呋喃類、酯類等在利川紅中含量較高，此外醛類化合物在3 種紅茶中含量均較高。

2.2.2 3 種紅茶風味成分相關性分析

萜烯指數是評價茶葉香氣品質和特征的一個重要指標，萜烯指數高，則香氣宜人，萜烯指數低，則香氣高銳[23]。宜紅、滇紅、利川紅萜烯指數分別為0.954、0.773、0.917，利用SPSS軟件進行偏相關分析可得，宜紅、利川紅的萜烯指數的偏相關顯著性P值為0.023，這說明二者香氣品質相似，在0.05水平上顯著相關；而利川紅和滇紅偏相關顯著性P值為0.515，這說明利川紅和滇紅的香氣品質有差異。

圖 5 基于重要風味物質的3 種紅茶PLS-DA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 5 Score (A) and loading plots (B) of PLS-DA based on the important aroma compounds

為了更好地進行3 種紅茶風味識別，利用SIMCA 14.1軟件對表3的9 種風味物質進行PLS-DA，結果見圖5。該建模方法能較好地區分3 種紅茶，其中和Q2分別為0.997、0.995、0.991，由圖5A可知，提取的2 個成分即可反映總體99.7%的原始變量信息，說明這2 個成分可反映紅茶香氣的總體情況；在主成分1上，3 種紅茶的風味品質可很好區分，但利川紅和宜紅的差異性要弱于利川紅和滇紅，這與萜烯指數相關性分析和圖6結果一致。各主成分的載荷值代表該主成分對該類物質反映程度的大小。由圖5B可知，香葉醇、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物等物質在第1主成分的載荷值較大；2-己烯醛、苯乙醛、檸檬醛、苯甲醛在第2主成分上的載荷值較大。

圖 6 3 種紅茶風味物質熱圖Fig. 6 Heat map of flavor components in three black teas

2.2.3 紅茶風味成分變量投影重要度（variable importance in projection，VIP）結果

圖 7 基于重要風味物質3 種紅茶PLS-DA的VIP和置換圖Fig. 7 VIP and permutation test of PLS-DA model based on the important flavor compounds

如圖7所示，通過PLS-DA的VIP值分析可知，芳樟醇、2-己烯醛、順式芳樟醇氧化物、香葉醇對3 種紅茶風味影響最大，VIP值均大于1，這幾種風味成分可作為3 種紅茶相互區分的主要特征標志物。通過交互殘差驗證方差分析得PLS-DA的預測模型P值為1.057×10-6，說明模型對3 種紅茶風味預測能力較好。

2.2.4 紅茶風味成分PLS-DA結果

圖 8 基于全部風味物質的PLS-DA得分圖Fig. 8 Score plot of PLS-DA based on all aroma compounds

以紅茶中全部風味物質為自變量，進行PLS-DA，如圖8所示。擬合模型的Q2分別為0.977、0.988、0.979，這些參數均低于基于重要風味物質的PLS-DA模型；交互殘差驗證方差分析得P值為2.422×10-5，大于基于9 種風味物質的模型參數，以上結果說明以紅茶中9 種風味物質為評價指標，不僅可以進行紅茶風味類型預測，而且優于基于全部風味物質的預測能力。

3 結論與討論

根據利川紅GC-MS總離子流圖，結合Owuor總結結果，選擇利川紅中匹配度不小于85的物質2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物、香葉醇、水楊酸甲酯、檸檬醛為利川紅的重要風味物質。以此9 種風味物質的種類和萃取峰面積為評價指標，采用單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗優化固相微萃取條件，確定最優料液比1∶4.11（g/mL）、萃取溫度71.75 ℃、萃取時間50.15 min，此時9 種重要風味物質的峰面積為（5.172±0.075）×109。

基于利川紅最優萃取條件，比較分析利川紅、宜紅、滇紅的風味差異。利川紅鑒定出的73 種風味物質中，以呋喃類、醛類物質為主，相對含量分別為21.202%和20.11%，其次是烷烴和酯類，相對含量分別為13.751%和11.662%。宜紅鑒定出59 種風味物質，呋喃、醇類、醛類和烷烴，相對含量分別為23.445%、21.04%、19.816%和18.070%。滇紅茶鑒定出66 種風味物質，醇類、醛類、呋喃類，相對含量分別為35.587%、15.103%和12.229%。

竹尾忠一等[29]將紅茶分為3 種主要香氣類型：第1種是以芳樟醇占優勢型，第2種是中間型，含有芳樟醇和香葉醇，第3 種是香葉醇占優勢型。香葉醇在宜紅、滇紅和利川紅的相對含量分布分別為1.215%、7.667%和1.736%，而芳樟醇及其氧化物的相對含量分別為25.279%、26.151%和19.246%；利川紅、宜紅中芳樟醇及其氧化物含量遠高于香葉醇，因此屬于第1種香型，而滇紅香葉醇相對含量達到了7.667%，屬于中間香型。本實驗結果所測實驗數據有別于其他研究者[24]，特別是香葉醇的含量差異較大，也可能與選取的樣品有關[32]，如所選茶葉的原料產地、茶葉等級、茶葉加工方法、風味物質的萃取方法等。

若以萜烯指數評判紅茶的香氣品質和特征，宜紅、利川紅的萜烯指數分別為0.954、0.917，二者香氣品質特征顯著相關，而滇紅為0.773，與利川紅香氣品質特征差異較大；熱圖分析結果與此一致。

分別對3 種紅茶中所有風味物質和9 種風味物質分析進行PLS-DA顯示，以紅茶中9 種風味物質為評價指標，不僅可以進行紅茶風味類型預測，而且其預測能力要優于基于全部風味物質。此外VIP分析也發現，芳樟醇、順式芳樟醇氧化物、香葉醇、2-己烯醛對3 種紅茶風味影響最大，這幾種風味成分可作為3 種紅茶相互區分的主要特征標志物。