褐藻膠裂解酶在枯草芽胞桿菌中的重組表達及催化特性研究

李星霖，吳 雯，徐翊文，李 恒，龔勁松，徐國強,4，史勁松，許正宏,4*

(1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；4.江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122)

褐藻膠裂解酶是降解褐藻膠的一種重要工具酶[1-2]，其降解產物褐藻寡糖具有廣泛的生理活性，包括調節血糖與血脂、抑制腫瘤、促進細胞因子分泌[3]，以及促進植物萌發與生長[4-5]等。此外，褐藻膠裂解酶本身也具有特殊的應用價值[6]，可以和抗生素聯用治療銅綠假單胞菌導致的囊胞性纖維癥[7]，也可與纖維素酶[8]聯合使用獲取海帶原生質體進行分子育種。伴隨基因工程技術的發展，有關褐藻膠裂解酶的研究已由最初集中于產酶微生物的分離，發展為利用模式表達體系進行工程菌的構建，可在實現酶高效表達的同時，簡化后續酶應用過程中的產物分離等環節。鑒于大腸埃希菌體系在食品與藥品中的應用受到較多限制，表達水平高且安全的枯草芽胞桿菌是酶的優選表達載體，廣泛應用于各種食品用酶的外源表達。已報道的產褐藻膠裂解酶的芽胞桿菌大多從自然界中直接分離得到，如從威海海產養殖場腐爛海帶中篩得的Bacillussp.Alg07等[9-10]。但野生枯草芽胞桿菌產酶酶活普遍較低，如從土壤中得到的產褐藻膠裂解酶的枯草芽胞桿菌經發酵優化后的酶活僅18.79 U/mL[11]。利用枯草芽胞桿菌表達褐藻膠裂解酶的工作還十分有限，最早見于20世紀末，Tomohiro等[12]將黃桿菌Flavobacteriumsp.來源的褐藻膠裂解酶A1-III轉化至枯草芽胞桿菌中表達得到0.3 mg/mL的重組酶。2020年，同是黃桿菌來源的褐藻膠裂解酶在枯草芽胞桿菌中成功表達[13]。由此可見，目前以枯草芽胞桿菌表達褐藻膠裂解酶的工作僅集中于黃桿菌屬，進一步拓展更多褐藻膠裂解酶基因資源在枯草芽胞桿菌中的重組表達與酶的應用，值得深入研究。本課題組(系統發酵與制藥工程實驗室)前期從一株產褐藻膠裂解酶的海洋細菌貝特氏菌(Cobetiasp.)WG-007中克隆得到褐藻膠裂解酶編碼基因aly-cob，并在大腸埃希菌中成功實現誘導型表達[14]。本研究進一步構建枯草芽胞桿菌工程菌，通過發酵工藝優化提高酶活，并通過酶學性質表征了解該酶催化性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 質粒pMA5、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)WB600 由系統發酵與制藥工程實驗室保藏；大腸埃希菌工程菌E.coliRosetta/pET-28a(+)-aly-cob為系統發酵與制藥工程實驗室自行構建。

1.1.2 培養基(g/L) ①LB培養基：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 5.0，去離子水溶解并定容至 1 L。②TB培養基：蛋白胨12.0，酵母粉24.0，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43，甘油4.0。培養基均121 ℃滅菌15 min，去離子水溶解并定容至 1 L。

1.1.3 試劑 QuickCutBamH I、QuickCutMluI、PrimeSTARPremixDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶均購自Takara公司；質粒DNA小量提取試劑盒、凝膠Clean柱回收試劑盒均購自上海捷瑞生物有限公司；酵母粉、蛋白胨等購自OXOID公司；海藻酸鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)均購自上海生工生物工程有限公司；多聚甘露糖醛酸(polyM)和多聚古羅糖醛酸(polyG)購自青島博智匯力有限公司，純度>97%；硫酸卡那霉素(Kan)購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純和化學純。

1.1.4 主要儀器與設備 紫外分光光度計(UV-2100，上海尤尼可儀器有限公司)；MicroPulser電轉儀(1652100，美國Bio-rad伯樂生命醫學產品有限公司)；核酸電泳系統(Mupid-2plus，日本COSMO BIO有限公司)；凝膠成像系統(GelDoc-It/EC3，美國Analytik Jena有限責任公司)；微量核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop One/OneC，美國Thermo Fisher賽默飛世爾公司)；生化培養箱(SPX-250B-Z，上海博迅實業有限公司)；組合式搖床(HYL-C，太倉市強樂實驗設備有限公司)；電子天平(ME204E，瑞士METTLER TOLEDO梅特勒-托利多公司)；pH計(FE28，瑞士METTLER TOLEDO梅特勒-托利多公司)；超聲破碎儀(JY92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；高速冷凍離心機(Himac CR22G，日本日立公司)；酶標儀(Multiskan Ascent，美國Molecular Devices美谷分子儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組枯草芽胞桿菌表達體系的構建 ①褐藻膠裂解酶基因克隆：設計帶有BamH I和MluI酶切位點的引物aly-F(堿基序列為GGGGATCCATGCGTAATACTCGG)、aly-R(序列為GAACGCGTTATCACTGAATCTTGC)，從實驗室自有的E.coliRosetta/pET-28a(+)-aly-cob工程菌質粒中擴增獲得目的基因aly-cob，反應體系見表1。對PCR產物進行驗證，并對驗證正確的目的片段產物進行回收。②質粒和PCR產物的雙酶切驗證：用BamH I和MluI快切酶分別對質粒pMA5和目的基因PCR擴增產物進行雙酶切，充分混勻后用T4 DNA Ligase連接12 h，然后通過電轉化法轉化至表達宿主菌B.subtilisWB600感受態細胞中，隨即挑取3～5個轉化子進行PCR驗證和雙酶切驗證，并對驗證正確的目的片段產物進行回收。

表1 PCR反應體系

1.2.2 菌株培養 ①菌株活化：取保存于-80 ℃甘油管菌株于0.1%Kan抗性固體平板上劃線，37 ℃培養14～16 h。②種子培養：從平板上挑取單菌落接入Kan抗性的LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min培養4～6 h。③搖瓶發酵培養：將種子液按1.0%(體積分數)接種量轉接至TB培養基，37 ℃、220 r/min培養30 h，測定發酵液酶活。

1.2.3 酶活測定方法 ①粗酶制備：取5 mL發酵液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，離心后菌體用200 mmol/L磷酸緩沖溶液洗滌2～3次除去殘留發酵上清，再用5 mL 200 mmol/L磷酸緩沖溶液重懸菌體后，冰浴條件下對菌體進行超聲破碎(工作3 s，間隔7 s，共30 min)。破碎后的菌懸液6 000 r/min離心10 min，取上清作為粗酶液，于冰上冷藏備用。②酶活測定：取0.1 mL粗酶液加入0.9 mL 1%海藻酸鈉溶液中，混勻后于45 ℃下反應20 min，然后向體系中迅速加入1 mL DNS，沸水浴3 min終止反應，迅速定容至10 mL，吸取200 μL加至96孔板，于520 nm處測定吸光值。對照組采用去離子水代替粗酶液。一個酶活單位(U)定義為在特定條件下，1 mL酶液每分鐘產生1 μg還原糖所需的酶量。

1.2.4 發酵優化實驗 ①發酵溫度：以1.0%(體積分數)接種量將重組菌B.subtilisWB600/pMA5-aly-cob接入TB培養基，在不同溫度(25、28、30、34、37、40 ℃)下發酵培養30 h，測定酶活。②初始pH：分別調節TB發酵培養基的初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，搖瓶培養30 h，測定酶活。③培養基碳源及濃度：以TB培養基為基礎，分別使用質量濃度為20 g/L的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖和甘油為碳源，搖瓶培養30 h后測定發酵液酶活。進一步考查優選碳源甘油的質量濃度(10、15、20、25 g/L)對酶活的影響。④培養基有機氮源及濃度：以TB培養基為基礎，分別使用質量濃度為20 g/L的酵母提取物、大豆蛋白胨、工業蛋白胨、酵母浸膏、玉米漿、牛肉膏和棉籽粉為氮源，搖瓶培養30 h后測定發酵液酶活；對優選的酵母浸膏進一步考查添加的質量濃度(15、20、25、30、35 g/L)對酶活的影響。

1.2.5 酶學性質研究 ①最適溫度和溫度穩定性：以含1%海藻酸鈉的50 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH 7.0)作為底物溶液，取重組菌上清酶液，分別在25、35、40、45、50、55和60 ℃溫度下測定酶活；將酶液放置于不同溫度水浴保溫30 min后迅速冷卻，測定殘余酶活。將酶液分別置于30、35、40、45、50 ℃恒溫水浴鍋中，每隔15 min取樣測定殘余酶活，確定重組酶在不同溫度下的穩定性。②最適pH和pH穩定性：分別配置不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的50 mmol/L磷酸緩沖溶液，再向磷酸緩沖溶液中加入1%海藻酸鈉配置成不同pH的底物測定酶活。將酶液分別加入至上述不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的50 mmol/L 磷酸緩沖溶液中，4 ℃孵育12 h后測定殘余酶活。③金屬離子的影響：配制含2 mmol/L金屬離子(Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Na+和K+)的酶液，4 ℃孵育1 h后測定殘余酶活，考察不同金屬離子對重組酶活的影響。對照為不含金屬離子的酶液。④Na+和K+的影響：考慮該酶來源于海洋微生物，進一步研究Na+和K+對重組酶活的影響。分別配制含NaCl和KCl的酶液，NaCl和KCl的濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0 mol/L。4 ℃下放置1 h后測定殘余酶活。⑤重組酶的底物譜：分別配制1%的海藻酸鈉、polyM、polyG、寡聚半乳糖醛酸、葡聚糖、巖藻聚糖、海藻糖、殼聚糖、瓊脂糖和纖維素的底物溶液，考察重組酶的底物特異性。

2 結果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶Aly-Cob枯草芽胞桿菌工程菌的構建

2.1.1 褐藻膠裂解酶基因aly-cob的擴增 將實驗室中保藏的含有褐藻膠裂解酶aly-cob基因的重組質粒進行PCR擴增，并引入酶切位點BamH I和MluI。擴增得到長度為1 059 bp的單一條帶，如圖1所示。經測序，所得片段大小與目的基因長度一致。

圖1 褐藻膠裂解酶基因片段PCR結果

2.1.2 重組質粒的構建與驗證 用限制性內切酶BamH I和MluI對表達質粒pMA5和PCR擴增產物分別進行雙酶切，連接后轉化至表達宿主菌B.subtilisWB600感受態細胞中。隨機挑取轉化子進行目的片段PCR擴增和重組質粒雙酶切的雙重驗證。結果表明，重組質粒PCR產物在1 000 bp處有單一條帶(圖2a)，雙酶切后在7 200 bp和1 000 bp附近均有清晰條帶，大小與pMA5和基因aly-cob一致(圖2b)。測序結果表明重組質粒構建成功，命名為pMA5-aly-cob，構建的工程菌命名為B.subtilisWB600/pMA5-aly-cob。

圖2 重組質粒pMA5-aly-cob PCR產物及雙酶切驗證

2.1.3 重組褐藻膠裂解酶的表達及酶活測定 構建好的工程菌接種于TB培養基，搖瓶培養后超聲破碎進行SDS-PAGE驗證以及酶活測定。如圖3所示，SDS-PAGE圖譜中顯示目的蛋白在35.7 kDa處有明顯表達。酶活測定發現，重組菌產酶主要以胞內酶的形式存在，初始酶活為21.71 U/mL，空白對照則未檢測到酶活(表2)。

表2 工程菌發酵產酶酶活

圖3 重組褐藻膠裂解酶Aly-Cob的SDS-PAGE分析

2.2 重組褐藻膠裂解酶的發酵優化

2.2.1 發酵溫度的優化 考查溫度對重組酶Aly-Cob發酵酶活的影響，結果如圖4所示。初始發酵溫度為37 ℃，有利于菌體生物量積累，但酶活不高；當溫度降到30 ℃時，最有利于重組菌產酶，酶活為29.80 U/mL。發酵溫度過高或過低同時影響菌體生長與產酶。

圖4 發酵溫度對產酶的影響

2.2.2 初始發酵pH的優化 不同pH對重組菌發酵液酶活情況的影響如圖5所示。重組菌在中性偏堿(pH 7.0～9.0)的環境里生長良好，pH 8.0時生物量最大。重組酶在pH為7.0的中性條件下酶活最高，為30.96 U/mL。酸性和堿性條件下酶活均受到一定程度抑制。

圖5 初始pH對酶活的影響

2.2.3 碳源的優化 選用常見的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖和甘油進行培養基碳源優化，結果如圖6a所示。發酵30 h時，麥芽糖作為碳源的酶活最高，為37.73 U/mL；甘油次之，酶活為33.53 U/mL，但生物量最大。考慮到發酵工業應用中甘油成本僅為麥芽糖成本的二分之一，選擇甘油作為碳源并做進一步的濃度優化。不同質量濃度甘油對酶活的影響如圖6b所示。添加質量濃度15 g/L的甘油發酵后，重組酶酶活最高，為40.30 U/mL，繼續提高甘油質量濃度，酶活下降。文獻報道，甘油濃度過高會影響甘油代謝酶促反應進而影響菌株生長和產酶[15]。因此，優先選擇質量濃度15 g/L甘油作為發酵培養基中的碳源。

圖6 碳源種類及甘油質量濃度優化

2.2.4 氮源的優化 選擇常用的酵母提取物、大豆蛋白胨、工業蛋白胨、酵母浸膏、玉米漿、牛肉膏和棉籽粉作為有機氮源進行培養基氮源優化。如圖7a所示，在添加酵母浸膏的培養基中，工程菌生物量與酶活均為最高，并顯著高于酵母提取物等其他氮源。故選擇酵母浸膏為氮源進一步優化濃度。如圖7b所示，重組菌生物量與產酶均隨酵母浸膏添加量的增加而增大。添加質量濃度為30 g/L的酵母浸膏時，重組酶Aly-Cob最高酶活為54.23 U/mL，繼續提高酵母浸膏質量濃度，酶活有下降趨勢。因此，優先選擇質量濃度30 g/L酵母浸膏作為氮源。

圖7 氮源種類及酵母浸膏質量濃度優化

2.2.5 重組菌發酵產酶 以優化后的培養基成分與培養條件對重組菌進行搖瓶水平發酵，結果如圖8所示。發酵初期，重組菌產酶與菌體生長呈正相關；發酵中后期，產酶比生物量略滯后，24 h時OD600達到最高，為10.9；48 h時，酶活達到最高，為58.62 U/mL。發酵后期菌體濃度和酶活均有所下降，這可能是由于重組菌菌體本身衰退而致[16]，也可能與發酵后期培養基中營養物質不足有關。

圖8 工程菌產褐藻膠裂解酶Aly-Cob的發酵曲線

2.3 酶學性質研究

2.3.1 最適溫度和溫度穩定性 溫度對重組褐藻膠裂解酶Aly-Cob酶活的影響如圖9a所示。40 ℃時，該酶相對酶活最高；當溫度低于或者高于40 ℃時酶活有明顯下降，說明該酶對溫度較為敏感，過高的溫度會導致酶結構破壞，而過低則使得酶促反應速率降低，影響酶活。重組酶在不同溫度下短時孵育后的殘余酶活測定結果顯示，低于35 ℃時，酶活仍保持90%以上，損失較少；溫度超過35 ℃時，殘余酶活明顯下降，但與相同海洋來源的褐藻膠裂解酶相比[17-19]，60 ℃時殘余酶活仍保持在55%以上，證明其在較高溫度下溫度耐受性較好。進一步考查重組酶不同溫度下的半衰期，如圖9b所示。重組酶在45 ℃以下的半衰期大于1 h，在45 ℃保溫1 h后殘余酶活為58.45%，證明重組酶在45 ℃以下具有良好的熱穩定性，經計算45 ℃下重組酶半衰期為1.29 h，與同屬海洋來源的印尼熱泉菌所產褐藻膠裂解酶接近[19]。

圖9 溫度對酶活及穩定性的影響

2.3.2 最適pH和pH穩定性 pH對重組酶Aly-Cob酶活的影響如圖10所示。在pH 7.0～8.0的范圍內酶活較高，其中pH為7.0時酶活最高，與目前所發現的來源于海洋微生物的褐藻膠裂解酶最適pH范圍相近[20]。重組酶在pH低于7.0條件下孵育后，酶活有較大幅度的降低，在pH 5.0時殘余酶活僅17%，說明該酶對酸性敏感，更適合中性到偏堿性的環境，與已報道的部分酶性質類似[8-9]，在pH 10.0時殘余酶活仍在60%以上。

圖10 pH對酶活及穩定性的影響

2.3.3 金屬離子對酶活的影響 金屬離子對重組酶Aly-Cob酶活的影響如表3所示。Mg2+、Ca2+、K+和Na+對重組酶活有顯著的促進作用，其中Mg2+、Ca2+可分別提高酶活37%和48%；Fe2+和Mn2+對重組酶的酶活性有抑制作用；而在有Cu2+存在的條件下，重組酶的酶活幾乎完全消失。根據以往報道，多數褐藻膠裂解酶在K+、Na+和Mg2+作用下存在促進作用[21]，Ca2+可作為穩定蛋白質結構的金屬離子存在[20]，促進酶活提高。

表3 金屬離子對酶活的影響

2.3.4 K+、Na+對酶活的影響 考慮該酶來源于海洋微生物，進一步考查K+、Na+對酶活的影響。由圖11發現，隨著NaCl和KCl濃度的增大，酶活均出現不同程度的提高。在NaCl與KCl濃度分別為5.0 mol/L時，酶活依舊未出現降低。其中，0.8 mol/L的NaCl和1.0 mol/L的KCl對重組酶的促進作用最大，酶活分別提高到原來的1.6倍和1.67倍，這與以往文獻報道的部分褐藻膠裂解酶對高濃度鹽有耐受性的性質一致[22]，說明該酶具有良好的耐鹽性能。

圖11 不同濃度K+、Na+對酶活的影響

2.3.5 重組酶底物譜 重組酶對不同底物的降解情況如表4所示。重組酶Aly-Cob僅能降解海藻酸鈉、polyM和polyG，而無法降解其他糖類底物，說明該酶的底物特異性較高。此外，該酶能同時降解polyM和polyG，說明該酶是一種雙功能酶，對polyM有降解偏好。

表4 重組酶對不同底物的降解能力

3 討 論

褐藻膠裂解酶是一種多糖裂解酶，在食品、醫藥、農業、能源等領域具有廣泛應用。目前已從海洋藻類、土壤、軟體動物等環境中分離獲得多種產褐藻膠裂解酶的微生物，并借助基因克隆以及組學等方法，成功挖掘并在大腸埃希菌模式體系中表達了多個產酶基因，提高了產酶水平，并可顯著簡化應用過程中微生物培養、產物分離等工作。但受限于大腸埃希菌在食藥行業中的應用限制，需要開發高效、安全的表達體系進行更替。枯草芽胞桿菌是食品級安全菌種，其生長速度快，營養要求不高，是重組表達褐藻膠裂解酶的優勢體系。目前以枯草芽胞桿菌體系重組表達褐藻膠裂解酶的工作較少，成功表達的產酶基因均來自于黃桿菌屬。通過高密度發酵，黃桿菌來源的褐藻膠裂解酶枯草芽胞桿菌的OD600達85左右、蛋白質量濃度為4.5 mg/mL，對應發酵液酶活提高到2 550 U/mL[13]。而如何充分利用現有豐富的褐藻膠裂解酶基因資源，進一步拓展發展更多來源的褐藻膠裂解酶在枯草芽胞桿菌中的重組表達具有重要的意義。

在前期將來源于海洋微生物Cobetiasp.WG-007褐藻膠裂解酶基因aly-cob在大腸埃希菌體系重組表達的基礎上，成功構建該基因的枯草芽胞桿菌工程菌BacillussubtilisWB600/pMA5-aly-cob，獲得無需誘導表達的重組酶Aly-Cob。通過發酵工藝優化，搖瓶發酵48 h褐藻膠裂解酶酶活最高為58.62 U/mL，是優化前的2.7倍。重組酶在40 ℃時酶活最高，對溫度較為敏感，更適宜于35 ℃及以下的環境；該酶對酸敏感，在pH為7.0時酶活最高，更適合中性偏堿的環境；金屬離子K+、Na+、Mg2+和Ca2+可顯著促進酶活提高，重組酶Aly-Cob具有良好的耐受高濃度K+和Na+的性能；該酶底物特異性高，僅能降解海藻酸鈉及其片段，是一種對polyM和polyG均有降解能力的雙功能褐藻膠裂解酶。綜上，在枯草芽胞桿菌體系中構建了無需誘導表達的重組褐藻膠裂解酶Aly-Cob，拓展了Cobetiasp.來源的褐藻膠裂解酶基因的重組表達工作，并利用發酵工藝優化提高酶活，通過酶學性質表征了解催化性能，為進一步推進褐藻膠裂解酶在食品、藥品中的應用提供參考。