白喉菌株主要抗原基因遺傳穩(wěn)定性及相應(yīng)抗原蛋白結(jié)構(gòu)確證的研究

顧 琴, 姬秋彥, 梁疆莉, 高 娜, 李婧妍, 蔡路奎, 史 荔, 孫明波, 馬 艷

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118)

白喉(diphtheria)是一種急性上呼吸道傳染病，由革蘭陽性白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)引起[1], 主要侵犯咽部形成灰白色假膜, 能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素, 通過血液循環(huán)將毒素?cái)U(kuò)散, 引起多種器官病變[2]。白喉一直是嚴(yán)重危害廣大少年兒童身體健康的主要傳染病之一[3], 起病急、進(jìn)展快, 嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性喉梗阻、神經(jīng)麻痹、中毒性心肌炎、中毒性腎病等并發(fā)癥而危及生命[4]。接種疫苗是預(yù)防白喉最有效、最經(jīng)濟(jì)的防控手段。白喉疫苗在研制及生產(chǎn)過程中，原始菌種需經(jīng)多次傳代，建立種子庫，工作種子批菌種也需多次傳代制備成疫苗。在此過程中，菌種可能會發(fā)生變異，從而引起生物學(xué)性狀的改變。因此，研究菌種的遺傳穩(wěn)定性對于疫苗抗原的穩(wěn)定性及疫苗的免疫效果有重要影響[5]。之前大多采用一代測序技術(shù)對菌種進(jìn)行核酸序列測序分析基因突變，但一代測序成本高、通量低、無法大規(guī)模進(jìn)行，因此出現(xiàn)了第二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)，NGS具有高通量、高速度、高分辨率和低成本等特點(diǎn)[6-7]。前期使用NGS對百日咳疫苗用菌株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性研究，取得較好的結(jié)果[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用NGS監(jiān)測白喉棒狀桿菌在傳代建庫及生產(chǎn)過程中白喉毒素結(jié)構(gòu)基因的突變情況，并采用蛋白免疫印跡技術(shù)確證相關(guān)蛋白，為疫苗的質(zhì)量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)PW8株CMCC38007購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁培養(yǎng)基、菌種培養(yǎng)基(2.59% N.Z amine)、產(chǎn)毒培養(yǎng)基(3.33% N.Z amine)，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所溶液組提供。

1.1.3 試劑與儀器 E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit(貨號E139650)購自美國Omega公司；白喉抗毒素國家參考品(批號0048，一抗)購自中國食品藥品檢定研究院；辣根酶標(biāo)記兔抗馬IgG(貨號PAB9272，二抗)購自Abnova公司。10 L細(xì)菌發(fā)酵罐(C10-3，德國賽多利斯公司)；GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng)(XRS，Bio-RAD公司)；SDS電泳儀(P25T，Bio-RAD公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(TURBO，Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的傳代和制備 將白喉棒狀桿菌PW8株原始菌種接種至馬丁培養(yǎng)基連續(xù)傳3代，制備主代種子庫(P3)；主代種子在馬丁培養(yǎng)基連續(xù)傳4代，制備工作種子庫(P7)；工作種子接種于菌種培養(yǎng)基連續(xù)傳4代，制備疫苗代次(P12)；疫苗代次再在產(chǎn)毒培養(yǎng)基上連續(xù)傳3代的第3代V3代次(P15)。以上各代次分別留樣待檢測。

1.2.2 二代測序分析白喉毒素基因穩(wěn)定性 ①細(xì)菌基因組DNA的提取：采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit分別提取白喉棒狀桿菌PW8株主代種子、工作種子、疫苗代次和V3代次的白喉毒素基因組DNA。②DNA測序：將提取的DNA樣品送上海源序公司構(gòu)建DNA文庫，并進(jìn)行白喉棒狀桿菌毒素基因二代測序。③序列分析：以Q30的值表示測序質(zhì)量，質(zhì)量值越高代表堿基被測錯(cuò)的概率越小，測序可靠性越高。再將測序結(jié)果與GenBank中登錄的相應(yīng)序列(基因庫登錄號為DT：CP003216.1)進(jìn)行比對，并分析主要抗原序列的堿基突變情況及突變率，特別是與結(jié)構(gòu)和免疫原性相關(guān)的重要位點(diǎn)的突變率。

1.2.3 菌株抗原結(jié)構(gòu)確證分析 ①DT結(jié)構(gòu)預(yù)測：二代測序后的堿基序列通過DNAMAN軟件翻譯成蛋白質(zhì)，再利用Phyre 2 軟件預(yù)測出白喉毒素結(jié)構(gòu)，該預(yù)測結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)發(fā)表的白喉毒素結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行比對。②蛋白免疫印跡檢測：將2018001、2018002、2018003共三批白喉純化液經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再與白喉抗毒素國家參考品(1∶400)室溫反應(yīng)1.5 h，PBS-T洗4次；再與辣根酶標(biāo)記的兔抗馬IgG(1∶30 000)室溫反應(yīng)1 h，PBS-T洗4次，加1 mL BeyoECL Plus顯色液后于Dynamica凝膠成像系統(tǒng)顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要堿基位點(diǎn)突變率分析

2.1.1 各代次測序可靠性分析 白喉棒狀桿菌主代代次和工作代次平均測序長度為150 bp，疫苗代次和V3代次平均測序長度為300 bp；總堿基數(shù)均值為7 647×106；Q30值為88.28%～93.96%，見表1。表明本次二代測序結(jié)果可靠性較高。

表1 白喉棒狀桿菌各代次菌株二代測序數(shù)據(jù)結(jié)果

2.1.2 抗原基因主要位點(diǎn)的突變率分析 白喉棒狀桿菌主要抗原全基因序列主代代次最高突變率為A580C 0.46%、A868C 0.46%，這2個(gè)位點(diǎn)均位于3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域中的T區(qū)(α-螺旋區(qū))，屬于白喉毒素B肽鏈，不是主要抗原區(qū)域，這2個(gè)位點(diǎn)其他代次突變率分別為工作代次A580T 0.47%、A868C 0.39%，疫苗代次A580G 0.43%、A868C 0.32%，V3代次A580C 0.45%、A868C 0.18%；工作代次最高突變率為A580T 0.47%，位于3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域中的T區(qū)(α-螺旋區(qū))，屬于白喉毒素B肽鏈，不是主要抗原區(qū)域，該位點(diǎn)其他代次突變率分別為主代代次A580C 0.46%、疫苗代次A580G 0.43%、V3代次A580C 0.45%；疫苗代次最高突變率為T507G 0.64%，位于3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域中的C區(qū)(催化區(qū))，屬于白喉毒素A肽鏈，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，該位點(diǎn)其他代次突變率分別為主代代次T507G 0.16%、工作代次T507G 0.37%、V3代次T507G 0.49%；V3代次最高突變率為T507G 0.49%，位于3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域中的C區(qū)(催化區(qū))，屬于白喉毒素A肽鏈，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，該位點(diǎn)其他代次突變率分別為主代代次T507G 0.16%、工作代次T507G 0.37%、疫苗代次T507G 0.64%，以上最高突變位點(diǎn)突變率均小于1%，見圖1。能影響白喉毒素進(jìn)入細(xì)胞和催化活性的36個(gè)堿基位點(diǎn)中，442堿基位點(diǎn)的各代次均比其他位點(diǎn)偏高(0.41%)，其他位點(diǎn)均小于0.45%，見圖2。

圖1 白喉棒狀桿菌各代次主要抗原堿基位點(diǎn)突變率

圖2 白喉棒狀桿菌各代次36個(gè)堿基位點(diǎn)突變率

2.2 抗原蛋白結(jié)構(gòu)確證分析

2.2.1 結(jié)構(gòu)預(yù)測確證分析 預(yù)測結(jié)構(gòu)(圖3A)與文獻(xiàn)發(fā)表的白喉毒素結(jié)構(gòu)模型(圖3B)[9]比對分析后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)模型均呈現(xiàn)出3個(gè)功能區(qū)：①C區(qū)(催化區(qū))：堿基位點(diǎn)為1～510 bp，以α+β-折疊為特征，屬于A肽鏈，有毒性，可使細(xì)胞內(nèi)延伸因子-2(EF-2)失活；②R區(qū)(受體區(qū))：堿基位點(diǎn)為1 141～1 605 bp，β-膠管狀受體區(qū)，位于B肽鏈C末端；③T區(qū)(α-螺旋區(qū))：堿基位點(diǎn)為511～1 140 bp，中心α-螺旋區(qū)，位于B亞單位，酸性條件下介導(dǎo)插入紙質(zhì)雙分子層，幫助A亞基的C區(qū)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。對比后顯示：預(yù)測模型與文獻(xiàn)發(fā)表結(jié)構(gòu)模型一致，初步說明白喉毒素蛋白結(jié)構(gòu)正確。

圖3 白喉毒素測序預(yù)測結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)發(fā)表結(jié)構(gòu)比較

2.2.2 蛋白免疫印跡(WB)試驗(yàn)結(jié)構(gòu)確證分析 三批白喉毒素純化液蛋白WB試驗(yàn)中，均在約58 kD處出現(xiàn)印跡條帶，蛋白大小與預(yù)期一致，且無雜條帶印跡，結(jié)果見圖4。根據(jù)一抗是針對白喉毒素的抗體，說明此條帶是白喉毒素蛋白，且純度較高。

圖4 白喉毒素蛋白免疫印跡

3 討 論

本研究對建立的白喉棒狀桿菌的主代種子(P3)、工作種子(P7)和疫苗代次(P12)及疫苗代次繼續(xù)傳3代的第3代V3代次(P15)，共4個(gè)代次菌體的白喉毒素抗原序列進(jìn)行二代測序，檢測該菌株在傳代過程中主要抗原基因的突變情況，分析菌種的遺傳穩(wěn)定性。

白喉毒素包含3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)：C區(qū)(催化區(qū))堿基位點(diǎn)為1～510 bp，屬于A肽鏈，以α+β-折疊為特征；T區(qū)(α-螺旋區(qū))堿基位點(diǎn)為511～1 140 bp，位于B肽鏈；R區(qū)(受體區(qū))堿基位點(diǎn)為1 141～1 605 bp均位于B肽鏈。B肽鏈C端與細(xì)胞表面受體結(jié)合，促使白喉毒素(diphtheria toxin，DT)內(nèi)吞，急速酸化，低pH引起DT結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致空泡型ATP酶質(zhì)子泵運(yùn)行，改變結(jié)構(gòu)后的DT在B亞單位的輔助下，插入細(xì)胞膜，形成跨膜離子通道，使A亞單位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中DT-A在核內(nèi)體胞漿中進(jìn)行重折疊，還原二硫鍵，之后被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中DT-A催化ADP-核糖由輔酶(NAD)向延伸因子2的轉(zhuǎn)化，由此使蛋白質(zhì)的合成失活和阻塞，最終使細(xì)胞死亡[10]。主要抗原全基因序列主代代次、工作代次最高突變率在白喉毒素B肽鏈的T區(qū)，不是主要抗原區(qū)域，疫苗代次、V3代次最高突變率在白喉毒素A肽鏈的C區(qū)，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，均小于1%。目前被廣泛研究的能影響白喉毒素進(jìn)入細(xì)胞和催化活性的氨基酸位點(diǎn)為21(His)、50(Try)、54(Tyr)、65(Tyr)、143(Glu)、148(Glu)、150(Try)、308(Pro)、349(Glu)、352(Asp)、365(Ile)、508(Ser)[11-16]，相對應(yīng)的堿基位點(diǎn)為61、62、63,148、149、150,160、161、162,193、194、195,427、428、429,442、443、444,448、449、450,922、923、924,1 045、1 046、1 047,1 054、1 055、1 056,1 093、1 094、1 095,1 522、1 523、1 524。這36個(gè)堿基發(fā)生改變會使相應(yīng)的氨基酸也發(fā)生改變，從而使白喉A肽鏈的催化活性失活或阻斷跨膜過程。其中922、923、924，1 522、1 523、1 524位點(diǎn)堿基與突變株型別相關(guān)。因此二代測序結(jié)果中，針對這12個(gè)氨基酸相對應(yīng)的36個(gè)堿基進(jìn)行了比對分析后發(fā)現(xiàn)，442堿基位點(diǎn)的各代次均比其他位點(diǎn)偏高(0.41%)，可能由于堿基偏好性引起，其他位點(diǎn)均小于0.45%。大量事實(shí)表明, 細(xì)菌在億萬年的進(jìn)化過程中, 基因組通常是保持相對穩(wěn)定的，以此來實(shí)現(xiàn)種系的繁衍, 但同時(shí)也需要一定的變異性來適應(yīng)環(huán)境的變化，即自然突變，自然突變率很低，且無規(guī)律性[17-18]。也有研究表明，疫苗菌毒株在合理的生產(chǎn)工藝過程中，一般無基因突變，若不合理的生產(chǎn)工藝，則會造成極高突變率出現(xiàn)[19]。研究中該36個(gè)堿基位點(diǎn)及抗原全基因組中，突變率均保持較低水平，且同一個(gè)位點(diǎn)不同代次的堿基突變呈不規(guī)律性，突變率沒有出現(xiàn)隨菌株傳代代次增加突變率逐漸增高趨勢，均呈不規(guī)律性，說明傳代過程中該36個(gè)堿基位點(diǎn)及抗原全基因組遺傳較為穩(wěn)定，也說明了該菌株的低突變率是與菌種本身特性有關(guān)。

預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)結(jié)構(gòu)比對后顯示，預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)發(fā)表結(jié)構(gòu)一致，初步說明白喉毒素蛋白結(jié)構(gòu)正確。蛋白免疫印跡試驗(yàn)?zāi)軌蛱禺愋越Y(jié)合相應(yīng)的抗體，說明本品白喉毒素蛋白的結(jié)構(gòu)正確。

本研究二代測序結(jié)果顯示，不同代次的白喉棒狀桿菌主要抗原基因突變率較低，特別是主要抗原位點(diǎn)中與催化活性相關(guān)的堿基突變率較低，這與之前一代測序結(jié)果一致[20]；預(yù)測結(jié)構(gòu)模型與文獻(xiàn)發(fā)表結(jié)構(gòu)模型一致，蛋白免疫印跡試驗(yàn)也顯示蛋白結(jié)構(gòu)正確。說明建立的白喉棒狀桿菌PW8株的主要抗原基因序列在傳代過程中，主代、工作代、疫苗代及疫苗后3代的突變率均保持較低的突變水平，遺傳較穩(wěn)定，相對應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)正確，為后續(xù)進(jìn)行疫苗研制提供參考。