降解雞毛真菌板蠟蚧的鑒定及產酶培養優化

劉宇星，沈 鑫，張芝元，韓燕峰，梁宗琦

(貴州大學 真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025)

角蛋白酶是一種誘導型蛋白酶，具有廣譜底物特性，能夠降解可溶性蛋白以及其他不可溶性蛋白，還可通過變性、水解及轉氨基作用等，將化學結構穩定的天然角蛋白的高級結構降解為氨基酸、多肽等次級結構[1-3]。角蛋白酶具有極大的綜合利用價值，可廣泛應用于處理各種角蛋白垃圾及廢棄物，解決因其大量堆積造成的生態環境污染和自然資源浪費等社會問題[4]。此外，角蛋白酶在動物飼料加工、食品行業、醫藥衛生、皮革脫毛、去除污垢等諸多方面均有著重要的應用價值和開發潛力，故其研究倍受重視[5-6]。微生物可誘導角蛋白酶的生成，無論是在放線菌，或是與細菌、真菌相關的研究中均可見角蛋白酶產生菌的報道[7-11]。真菌來源的角蛋白酶較細菌來源的角蛋白酶更容易獲得和純化，其開發和研究備受關注[12]。現有資料顯示，真菌是最早被發現可產生角蛋白酶且能夠降解角蛋白的微生物[7]，1899年，Ward 等[13]在其研究中提到：由馬爪甲團囊菌(Onygenaequina(Willd.)Pers.)分離得到的角蛋白酶能夠被應用于角蛋白的降解中，隨后數年，全球各國學者開始了基于角蛋白降解真菌的相關研究。主要涉及皮膚類真菌，如小孢子菌屬(MicrosporumGruby)[14]、節菱孢屬(ArthriniumKunze)[15]和賽多孢屬(ScedosporiumSacc.ex Castell.& Chalm.)[16]等；后來發現很多非皮膚類真菌也能產生角蛋白酶，如曲霉菌屬(Aspergillus)P.Micheli)[17]、金孢屬(ChrysosporiumCorda)[18]等。早期以角蛋白降解菌的分離和篩選，角蛋白酶的純化和理化性質研究等為主。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展和完善，利用基因工程技術對角蛋白酶基因進行了改造，解決了野生菌株角蛋白酶純化困難、天然角蛋白酶穩定性差的問題[5]。目前角蛋白降解菌株仍存在產酶水平低、發酵周期長、研究技術不夠成熟、生產成本高[19]等問題，故需不斷優化角蛋白降解菌株的產酶培養條件，以降低成本，便于工業化應用。本研究從貴州醫科大學附屬醫院花壇土中分離得到3株角蛋白高效降解真菌，對其進行鑒定并優化其產酶條件，以期為真菌角蛋白酶的科學研究和發展應用提供理論基礎與新興真菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 于加入無菌雞毛粉30 d的貴州省貴陽市云巖區貴州醫科大學附屬醫院花壇土中分離獲得3株形態一致的角蛋白降解真菌1Y2-12、1Y1-12-2和1Y1-12-3，菌株被完整保藏于貴州大學真菌資源研究所(GZAC)和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(編號:CGMCC 19366)。

1.1.2 培養基 ①PDA培養基：用于菌株的活化及形態描述。②加雙抗和孟加拉紅的PDA培養基：加入孟加拉紅3.3 mL于PDA培養基中，pH自然，121 ℃滅菌 20 min。使用前，待溫度冷卻至40 ℃左右，加入青霉素20 μg/mg，鏈霉素40 μg/mg，用于分離和純化菌株。③發酵基礎培養基(g/L)：雞毛(經浸泡后多次用水沖洗，烘干后剪至3～5 mm，滅菌)5.0 g，氯化鈉1.2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1.2 g。pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。用于菌株產角蛋白酶的單因素優化實驗。

1.1.3 試劑與儀器 青霉素、鏈霉素、無水乙醇、孟加拉紅、75%乙醇、丙三醇、葡萄糖、瓊脂糖、蛋白胨、乳酸、K2HPO4、KCl、MgSO4、NaNO3、FeSO4、牛血清蛋白購自Sigma公司，考馬斯亮藍G250購自上海試劑公司，真菌基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)。高速離心機(Mikro 22R，德國Hittich)；制冰機(SIM-FI24，日本SANYO)；漩渦震蕩儀(WORTOEX 4 digital，德國IKA)；凝膠成像儀(Gel Doc XR，美國BIO-RAD)；數碼顯微鏡(Moticl 300，麥迪奧公司)；電泳儀(DYY-2，北京六一)；滅菌鍋(YXQSG41，上海醫用核子儀器廠)；PCR擴增儀(PTC-100TM，美國MJ Reaserch Inc)。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態觀察與鑒定 將待測定真菌菌塊接種于PDA培養基，25 ℃培養14 d，測量菌落直徑并記錄菌落形態。取已培養好的真菌，用透明膠帶將菌落邊緣的菌絲粘取下來，并以其制片。顯微鏡觀察真菌的孢子大小、形狀以及孢子結構[20-21]。參照已創建的蠟蚧屬Access數據庫進行形態鑒定。刮取PDA培養基上的菌絲以及孢子，按照真菌基因組DNA提取試劑盒的相關操作步驟，完成DNA提取[22]，并于-20 ℃保存備用。通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)用以擴增ITS區域，將上一步驟得到的擴增產物送昆明碩擎生物技術有限公司測序，測序序列報送GenBank(MT512658、MT512659、MT512660)。采用Clustal X 2.1、MEGA 6.0針對序列加以比對，并按照相關要求剪齊，利用RxAML軟件構建最大似然樹(最大似然法)，經過1 000次bootstrap后，建立系統發育樹。

1.2.2 孢子懸浮液與粗酶液的制備 前期預實驗發現，3株菌株對雞毛的降解效果存在差別，選用降解效果較好的菌株1Y2-12，進行單因素和正交實驗優化角蛋白酶的發酵實驗。1Y2-12分生孢子懸浮液的濃度配置為107個/mL，取1 mL加入250 mL的三角瓶中(瓶中裝100 mL發酵基礎培養基)，25 ℃，120 r/min培養7 d，發酵液4 000 r/min離心5 min，快速定性濾紙過濾，經標準離心后得上清液，即粗酶液。

1.2.3 酶活力的測定 在pH 8.0條件下，將0.5 mL粗酶液和20 mg底物(雞毛粉)置入預先準備好的9.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，120 r/min，37 ℃反應2 h，立即用冰水冷卻10 min，停止反應。用濾紙過濾，濾液再經0.45 μm真空纖維微孔過濾器進行二次過濾[23-24]。以發酵基礎培養基上清液為對照，測量280 nm處的吸收值。酶活力定義為在37 ℃、pH 8.0的環境條件下，水解角蛋白1 h。以0.01作為一個單位增加量，光吸收值(對照空白組)每出現一個單位的增加量，相應的酶活力為1個酶活力單位(U)，前后需測量3次，取3次結果平均值[24]。酶活力(U/L)=1 000×測定所得的酶活力單位(即：0.5 mL×2 h×(OD值/0.01)×1 000)。

1.2.4 菌株1Y2-12液體發酵產酶的單因素優化 ①碳源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響：100 mL發酵基礎培養基的三角瓶中，定量添加質量分數為2%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖，接種1 mL 1.2×107個/mL的孢子懸浮液，25 ℃，120 r/min培養7 d。以發酵基礎培養基上清液作為空白對照，測定酶活力。②氮源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響：100 mL發酵基礎培養基的三角瓶中，定量加入質量分數為0.1%的蛋白胨、牛肉膏、尿素、酵母膏，接種1 mL 1.2×107個/mL的孢子懸浮液，25 ℃，120 r/min培養7 d。以發酵基礎培養基上清液作為空白對照，測定酶活力。③不同無機離子對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響：100 mL發酵基礎培養基的三角瓶中，定量加入質量分數為0.01%的Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+以及Fe2+，接種1 mL 1.2×107個/mL的孢子懸浮液，25 ℃，120 r/min培養7 d。以發酵基礎培養基上清液作為空白對照，測定酶活力。

1.2.5 正交實驗 為獲得菌株1Y2-12降解雞毛的最優發酵條件，確定各實驗因素的最佳組合，再結合單因素實驗的結果，以乳糖(A)、酵母膏(B)、Zn2+(C)3個因素作為影響因子，以角蛋白酶活力大小為影響值，設計正交實驗，各因素水平和取值見表1。

表1 菌株1Y2-12產角蛋白酶正交實驗設計

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株1Y2-12形態描述 將菌株1Y2-12接種于PDA培養基，25 ℃培養14 d，菌落直徑25 mm左右，顏色介于白色、淡黃色之間，偏向短絨狀，中心褶皺，邊緣相對規則，背面呈淡黃色。菌絲光滑，寬約0.3～1.0 μm，分隔；分生孢子梗長度不定，其上著生錐形瓶梗，大多單生，(15～45)μm×(0.5～1.0)μm；分生孢子呈側生或頂生分布，梭形，(3.5～5.0)μm×(0.5～1.5)μm，或橢圓形、卵圓形至腎形，(1.5～3.0)μm×(1.0～1.5)μm，常聚集成團。見圖1。

圖1 菌株1Y2-12的菌落特征和產孢結構

2.1.2 分子鑒定 以SimplicilliumlanosoniveumCBS704.86為外群，基于蠟蚧霉屬的50條序列選用的是最大似然法，結合具體要求構建系統發育樹，結果見圖2。蠟蚧霉屬不同菌株能獨立于外群較好地聚在一起，本研究分離的3株菌株1Y2-12、1Y1-12-2、1Y1-12-3和板蠟蚧(Lecanicilliumtestudineum)的菌株以100%的支持率聚為一獨立的亞支。結合形態特征將其鑒定為板蠟蚧(Lecanicilliumtestudineum。)

圖2 3株菌株與蠟蚧屬內種基于ITS-5.8S rDNA序列構建的系統發育樹

2.2 高效角蛋白降解真菌液體發酵產角蛋白酶活力的單因素優化

2.2.1 碳源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響 由圖3可知，在基礎發酵培養基中分別加入2%(質量分數)的4種不同碳源，得到的酶活力相較于未添加的偏高。結果表明，這些碳源均對酶活力具有促進作用。根據不同碳源對菌株酶活力的差異性分析，4種碳源對不同菌株的酶活力具有促進作用，綜上文分析，將其依次排列為乳糖>蔗糖>葡萄糖>淀粉，其中，乳糖的促進作用最為明顯。

圖3 碳源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響

2.2.2 氮源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響 由圖4可知，在基礎發酵培養基中分別加入0.1%(質量分數)的4種氮源，所測得的酶活力均存在顯著性差異；各氮源均可促進酶活力提高；根據不同氮源對菌株酶活力影響的差異分析，4種氮源對菌株酶活力影響的大小順序為酵母膏﹥牛肉膏﹥蛋白胨﹥尿素，其中以酵母膏對角蛋白酶活力的促進作用最大。

圖4 氮源對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響

2.2.3 無機離子對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響 由圖5可知，分別于基礎發酵培養基中添加0.01%的5種無機離子時，酶活力存在顯著性差異。當添加Zn2+和Mn2+時，菌株的酶活力升高，表明Zn2+和Mn2+對酶活力均有促進作用，且Zn2+對菌株酶活力的促進作用最大。加入Ca2+時，與對照相比，促進作用不大；而加入Cu2+和Fe2+時，菌株酶活力下降，說明Cu2+和Fe2+對菌株酶活力均具有抑制作用。不同無機離子對菌株酶活力作用的差異性分析表明，5種無機離子對菌株產角蛋白酶活力作用的大小排序依次為Zn2+>Mn2+>Ca2+>Cu2+>Fe2+。Zn2+對菌株產角蛋白酶活力的影響最大。

圖5 無機離子對菌株1Y2-12產角蛋白酶活力的影響

2.3 正交實驗結果

對菌株1Y2-12降解雞毛的最優發酵條件進行了三因素三水平的正交實驗，測定角蛋白酶活力(見表2、表3)。

從表2和表3可看出，針對酶活力的方差分析進行探究后發現，基于菌株1Y2-12產酶的影響效果由大到小為B>C>A，即酵母膏>Zn2+>乳糖，其中以酵母膏對菌株發酵產酶的影響最顯著。從K值來看，菌株1Y2-12產酶最為理想的培養條件可設定為A2B3C1，正交實驗得到的最佳培養條件為酵母膏0.15%，乳糖2%，Zn2+0.01%，在此條件下菌株1Y2-12酶活力為22.03 U/mL，是未優化前的2.1倍。

表2 菌株1Y2-12產角蛋白酶活力正交實驗分析

表3 菌株1Y2-12發酵正交實驗方差分析

3 討 論

本研究分離篩選的3株菌株與Zhou等[25]報道的L.testudineumsp.nov.形態特征基本一致，并與2個L.testudineum序列以100%的支持率聚在一起，綜合形態特征和分子系統學分析結果，將3株菌株鑒定為板蠟蚧(LecanicilliumtestudineumHubka, Kubátová, Schauflerová, Déniel & Jany)，為中國新記錄種。蠟蚧菌屬于子囊菌綱肉座菌目蠟蚧屬，現有30個種[26],可寄生多種害蟲，目前主要被廣泛應用于生物防治，如絲枝蠟蚧菌(L.aphanocladiiZare & W.Gams)[27]、蛀蟲蠟蚧菌(L.cauligalbarumX.Zou, J.R.Zhi & Y.M.Zhou)[1]、漸狹蠟蚧菌(L.attenuatumZare & W.Gams)[28]、長孢蠟蚧菌(L.longisporum(Petch)Zare & W.Gams)[29]等均具有生防潛力。國內外學者相繼報道了能降解角蛋白多個屬的真菌，如發癬菌屬、串胞菌屬、曲霉屬、金孢屬、毀絲霉屬、帚霉屬和賽多孢屬等[30]。本研究首次發現蠟蚧菌屬真菌對雞毛角蛋白具有較好的降解效果，該結果豐富了角蛋白降解真菌資源并為降解角蛋白真菌的開發提供參考。

多項研究結果表明，營養條件的差異往往會影響微生物菌株的正常生長發育。如果養分相對匱乏會直接或間接影響到菌株性狀，使之呈現出不同程度的退化現象，如出現產孢量下降、菌落局變、毒力降低等反應[31-32]。角蛋白降解菌的產酶活力也受營養條件所控制，對其影響的營養因素很多，如碳氮源、無機離子等。其中，碳源是微生物生命活動的主要能量來源，是組成細胞的主要元素[33]；氮源對于微生物生長和繁衍具有重大影響，是構成蛋白質的主要成分[32]；無機離子一般作為輔酶成分或充當輔酶功能[34]。學者們將研究重點放于培養基組分、培養條件上，在此基礎上對酶活力的影響展開研究，并基于如何優化角蛋白降解菌相應的產酶條件進行討論[4，35-36]。周禮瑋[37]設計Plackett-Burman實驗與Box-Behnken優化，篩選并確定了菌株GZD-23產角蛋白酶的最佳接種量、溫度和培養基組成等，在此優化條件下，該菌的酶活力提升了1.05倍。張秀江等[36]基于優化了菌株BacillussubtilisYKM05 產角蛋白酶發酵條件及培養基的相關研究，給出了最佳誘導物、碳源、氮源等參數，酶活力于優化后提高了3.5倍。朱耀霞等[38]對菌株B.subtilisFJ-3-16的發酵培養進行了單因素實驗和正交實驗，其酶活力大幅提高至78～100 U/mL。本研究對菌株1Y2-12降解雞毛角蛋白的發酵培養基組成進行了優化，酶活力提高了2.1倍。此外，在不同碳源、氮源、無機離子的單因素實驗中發現，以乳糖為碳源，酵母膏為氮源，Zn2+為無機離子，促進了菌株的產酶能力。這與蔣彪[39]的研究結果不太一致，他們發現當向培養基中添加硫酸鋅后，菌株Bacillussp.CJPE209的酶活力反而受到強烈抑制。Mini等[40]報道，發酵培養基中添加的碳源、氮源對菌株AspergillusflavusLink S125酶活力的影響不大。Anbu等[23]也發現乳糖作為碳源時，會對短尾帚霉ScopulariopsisbrevicaulisBainier產角蛋白酶產生抑制作用。本研究中所涉及的最適碳源、氮源和無機離子與其他研究存在差異，這可能是由于不同微生物菌株的生長條件和其對添加的碳、氮源及無機離子的利用程度存在差異。

本研究發現板蠟蚧對雞毛角蛋白同樣有很好的降解效果，而對于這類昆蟲病原菌，產角蛋白酶是否為該屬真菌的特性還有待對該屬的其他種做進一步研究。本研究僅對碳源、氮源、無機離子對菌株1Y2-12產角蛋白酶的影響進行了初步研究，而影響其產酶條件的因素很多，且各因素間存在復雜的交互作用，因此對其產酶發酵條件的研究也需要進行更多的實驗。