不同組織分離期對大圓頭蛹蟲草菌種性能的影響

李劍梅，馮 敏，謝存一，柴林山，朱萬芹，張疏雨

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(Vuill.)Fr.)也稱北蟲草,屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)麥角菌科(Clavicepitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，是我國一種兼具食用和藥用珍貴價值的優質大型真菌[1-3]。經研究證實，其化學成分與冬蟲夏草相近，含有蟲草素、蟲草酸、氧化物歧化酶(SOD)、噴司他丁、麥角甾醇等生物活性物質及蛋白質、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素，具有滋補營養、增強免疫及抗腫瘤、抑制病毒、抗輻射、抗菌消炎等多種營養、保健及藥用功能[4-8]。蛹蟲草是目前公認的食藥用蟲草之一，在我國已經形成了一個巨大的產業，年產值可達100億元人民幣[9],栽培品種主要有尖頭蛹蟲草、大圓頭蛹蟲草。其中，大圓頭蛹蟲草因子實體頂端膨大、呈蝌蚪狀而得名，具有色澤金黃、子囊孢子豐富、口感鮮脆、香味濃郁等特點，深受廣大消費者喜愛，在我國內蒙古赤峰等大部分地區廣泛栽培。菌種退化是菌類栽培過程中普遍存在的問題，蛹蟲草菌株在繼代培養和保藏的過程中容易退化[8-9]。大圓頭蛹蟲草是通過人工馴化及科學管理而獲得的栽培品種，菌種容易變異和退化，保存期短，已成為其規模化人工栽培關鍵技術瓶頸之一。菌種質量是蛹蟲草人工栽培成敗的前提條件，研究和建立科學有效的優良母種選育方法，選育、保持大圓頭蛹蟲草優良菌種性能，對大圓頭蛹蟲草規?；a具有重要意義。研究表明，組織分離法是一種常用食用菌菌種繁殖方法，具有操作簡單等優點[10]。本研究從生產實際出發，采用組織分離方法，對不同組織分離期的大圓頭蛹蟲草菌種性能進行了比較試驗研究，明確其組織分離最佳時期，為提高大圓頭蛹蟲草人工栽培用優良生產母種篩選效率，提升菌種質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大圓頭蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)不同生長發育時期子實體，由遼寧省微生物科學研究院藥用蕈菌研究室提供。

1.1.2 培養基 ①PDA加富培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，瓊脂16 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；②液體種子培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，瓊脂16 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；③人工栽培培養基：以650 mL罐頭瓶為培養容器，每瓶裝培養料40 g(小麥∶豆粕=8∶1)，按照1∶1.7(g/mL)的比例添加營養液(葡萄糖10 g, MgSO41 g,KH2PO42 g，蛋白胨5 g,VB15 mg，配制成1 000 mL溶液，pH自然)，用聚丙烯塑料膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎緊，121 ℃保持1 h。

1.1.3 主要儀器與設備 立式壓力蒸汽消毒器(LDZX-75KBS，上海申安醫療器械廠)；超凈工作臺(SW-CJ-2，江蘇蘇靜儀器儀表有限公司)；電熱恒溫培養箱(DHP-PZ72，上海一恒科技有限公司)；生物顯微鏡(CKX41，OLYMPUS日本)。

1.2 方法

1.2.1 實驗用子代母種組織分離 選取培養時間分別為35 d(無有性孢子期)、40 d(子囊殼形成初期)、45 d(子囊孢子形成初期)、50 d(子囊孢子成熟期)發育良好、生長健壯、無污染的大圓頭蛹蟲草新鮮子實體，用75%酒精對培養瓶表面進行消毒，無菌打開栽培瓶的封口膜，取出供試新鮮子實體于無菌培養皿中，用無菌手術刀取子實體頭部膨大部分，去除表皮并無菌切成0.2 cm的小段，用接種針接入預先制備好的PDA加富平板培養基上，18 ℃恒溫、避光培養，當組織塊在培養基上形成直徑1.5 cm菌落時，挑取生長健壯的菌落邊緣菌絲于預先制備好的PDA斜面培養基上，每個組織分離期制備純化菌株25株，18 ℃避光、恒溫培養至菌絲長至1/2斜面，獲得實驗用子代母種，備用。

1.2.2 不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響 無菌挑取2 mm2大小的實驗用子代母種新鮮菌種塊，分別接種于PDA加富平板培養基上，18 ℃避光、恒溫培養，依次觀察各組母種菌絲色澤、長勢、轉色、生長速度等情況，對各組供試菌株菌絲生長性狀優良率進行差異化分析，考察不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響。各組子代母種優良率(%)=(生長性狀優良菌株數/子代母種總數(25))×100%。

1.2.3 不同組織分離期對子代母種液體培養性狀的影響 另取上述各母種，無菌挑取1 mm2大小的菌種塊3～4塊，轉接至裝有100 mL液體培養基的 500 mL三角瓶內，18 ℃、140 r/min，避光培養4 d，以菌球及發酵液表觀形態、生物量為考核指標，計算各組供試菌株菌種優良率，考察不同組織分離期對子代母種液體菌種培養性狀的影響。生物量測定采用恒重稱量法，即將培養好的液體菌種經紗布過濾，然后用適量的蒸餾水洗滌3次，收集菌絲體置于已知重量的稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重，稱量，按照下式計算生物量(以每100 mL發酵液中菌絲體干重表示)。

式中：W1為菌絲體與稱量瓶質量和(g)；W0為稱量瓶質量(g)；V為發酵液體積(mL)。

1.2.4 在麥粒培養基上各子代母種菌絲培養性狀及子實體形成能力的比較 取培養好的子代母種的液體菌種，分別無菌噴灑于栽培培養基料面上，置于人工氣候室18 ℃、避光、空氣相對濕度不低于35%環境條件下培養15 d左右，當培養基表面形成菌絲被，且菌絲被表面有明顯龜被紋時，搔菌轉色，24 h給予300 lx的光照，20 ℃、空氣相對濕度不低于50%、二氧化碳濃度低于0.5%條件下培養3～4 d，誘導原基形成；當搔菌溝內現淡黃色原基時，用接種針在封口膜上扎眼通氣(扎兩排孔，每排扎3個直徑約0.2 mm的小孔)，繼續培養至60～65 d，子實體頭部膨大呈球形且著生豐富的子囊殼，表明子實體已經成熟，即可獲得子代母種子實體。在子實體培養過程中，觀察比較各組子代母種在栽培培養基上菌絲長勢、菌絲被表觀形態、轉色能力、子實體形態、產量及比例，對不同組織分離期子代母種在麥粒培養基上培養性狀及子實體形成能力進行比較分析。子實體產率計算方法：

2 結果與分析

2.1 不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響

結果表明，試驗范圍內，在PDA加富平板培養基上，組織分離期為35、50 d的子代母種生長速度明顯低于對照母種，在菌絲長勢及轉色能力方面，菌種優良率較低，與組織分離期為40、45 d的子代母種相比，形成了明顯差異。以40、45 d子實體為分離材料所獲得的子代母種生長速度、菌絲長勢與對照母種最為相近，絕大多數菌株菌絲健壯、濃密且爬壁能力、轉色能力較強，菌種優良率達到90%以上；其中以組織分離期40 d的子代母種菌絲生長速度最快(3.187 mm/d)，菌絲健壯、濃密、匍匐狀，轉色均勻、淡黃，菌種優良率最高，除1株子代母種菌絲長勢弱外，其余菌株具有與對照母種相近的良好生長性狀，菌種優良率達到96%。由此可見，不同組織分離期對子代母種在斜面培養基上生長性能具有一定的影響，組織分離期為40 d的子代母種較好地保持和遺傳了對照母種的生長性能。這主要是由于該時期子實體頭部形成豐富的子囊殼，處于子囊孢子形成早期，菌絲體細胞處于分化能力最強及活力最高時期，在該時期進行組織分離得到的母種活力及長勢最好(表1)。

表1 不同組織分離期制備的母種在斜面培養基上的生長性能比較

2.2 不同組織分離期對子代母種液體培養性狀的影響

液體菌種的培養是蛹蟲草人工栽培的重要環節，蛹蟲草液體菌種長勢是子實體培養成敗的前提條件。試驗以母種為對照，對不同組織分離期獲得的子代母種液體培養性狀進行了差異化比較試驗。結果表明，不同組織分離期的子代母種液體菌種培養性狀分化程度存在一定的差異；其中35 d組織分離期子代母種液體菌種培養性狀分化明顯，液體菌種優良率僅為76%，45、50 d組織分離期子代液體菌種優良率分別為88%、84%，40 d組織分離期子代母種液體菌種培養性狀一致性最好，90%以上的子代母種生物量(≥3.1%)高于對照母種(3.1%)，且其液體菌種培養性狀與對照母種相同，菌球較細密均勻、菌液黏稠；結果表明，各子代母種液體培養性狀優良率差異與其在PDA加富平板培養基上菌絲生長性能差異基本一致，二者明顯正相關，這主要是由于蛹蟲草菌株在適宜的液體培養條件下，優良子代母種的菌絲生命力旺盛、生長迅速，且組織分離法為無性繁殖，不易產生遺傳物質變異，其子代母種菌絲優良的培養性狀得到穩定遺傳(表2)。

表2 不同組織分離期子代母種液體培養性狀的比較

2.3 麥粒培養基上各子代母種培養性狀及子實體形成能力比較

栽培試驗是全面檢驗菌種性能的根本方法,出草情況是菌種綜合性能的全面反映[7]。在大圓頭蛹蟲草實際生產過程中，在麥粒培養基上，優良的大圓頭蛹蟲草菌種菌絲長勢旺盛，形成厚0.5～1.0 cm的菌絲被，在適宜條件下，避光培養15 d，菌絲扭結形成典型的龜背紋，見光后菌絲轉色成均勻的淡黃色，子實體通體金黃，頭部膨大呈球形，子實體蝌蚪狀，且密度適中，整齊一致(圖1)。

圖1 大圓頭蛹蟲草優良母種在麥粒培養基上的長勢

栽培試驗結果(表3、表4)表明：組織分離期為40 d的子代母種培養性狀表現最優，45 d次之，50 d最差。組織分離期為40 d的子代母種中，92%子代母種與對照母種菌絲長勢相近，菌絲長勢旺盛，菌絲被較厚，84%的子代母種在菌絲被表面形成典型龜背紋，見光轉色迅速、均勻，子代母種培養性狀優良率達到了84%。實驗結果還說明：試驗菌株子實體形成能力與菌種培養性狀表現出顯著的相關性，組織分離期40 d的子代母種優良菌株篩選率最高(48%)；45 d次之(44%)，50 d最低(32%)；并且在各組子代母種中，以菌絲長勢旺盛、菌絲被較厚的各組子代母種子實體形成能力表現最優，多數菌株與對照母種相似，在菌絲被表面形成典型的龜背紋，見光后菌絲迅速轉色成均勻的淡黃色，形成的子實體商品性狀良好；菌絲長勢極旺盛、菌絲被厚的子代母種則分化明顯，多數菌株菌絲氣生性強、菌絲被厚且無龜背紋、轉色不均一或不轉色，子實體形成能力也較弱；而菌絲長勢弱、菌絲被薄的試驗菌株均無典型的龜背紋，轉色能力及子實體形成能力差，不能形成正常子實體。菌種分化主要是由于蛹蟲草菌株具有較強的遺傳不穩定性，在菌種分離及人工培養過程中，部分菌株由于營養條件、環境條件等方面的影響，造成可育性控制基因丟失，出現菌絲徒長、敗育等現象。綜合各組子代母種在栽培實驗中菌種性能表現，以組織分離期為40 d的子代母種性能最優，這一結果與各組子代母種菌絲生長性狀及液體培養性狀考察結果一致。因此，大圓頭蛹蟲草菌種組織分離最佳分離期為40 d。

表3 不同組織分離期子代母種在麥粒栽培培養基上培養性狀的比較

表4 不同組織分離期子代母種在麥粒栽培培養基上子實體生長情況的比較

3 討 論

組織分離法可較好地保持和遺傳母種的優良性狀，且操作較為簡便，遺傳變異性較低，是大圓頭蛹蟲草母種篩選及復壯的重要手段之一。試驗通過對不同組織分離期(35、40、45、50 d)子代母種平板培養、液體培養及栽培實驗，對不同組織分離期子代母種性能進行了科學評價，綜合各組子代母種在PDA加富平板培養基的菌絲生長性狀、液體培養性狀及栽培實驗考察結果，以40 d子代母種優良菌種篩選率最高(48%)，45 d次之(44%)，50 d最低(32%)，明確了大圓頭蛹蟲草菌種組織分離最佳分離期為40 d。

相關研究證明，蛹蟲草菌種特別容易退化，一般經過一段時間保藏或傳代，其菌種性能可發生嚴重衰退，產量及活性物質含量顯著降低，甚至不轉色、不形成子實體，需經常對菌種進行復壯或選育[14-15]。試驗中發現，大圓頭蛹蟲草子代母種子實體形成能力與其培養性狀具有顯著相關性，且優良的子代母種具有與試驗對照母種相近的培養性狀，在PDA加富培養基上菌絲健壯、濃密、爬壁能力強、轉色均一，液體培養條件下菌球細密、黏度適中，在麥粒培養基上可形成厚度適中的菌絲被，并形成典型的龜背紋，見光后轉色迅速均勻，子實體整齊、形態好、產量高。因此，在大圓頭蛹蟲草菌種選育、復壯過程中，可依據優良子代母種在各培養時期的培養特性，對所獲子代母種性能進行預判，淘汰可育性較差的菌株，進而減少工作量，提高菌種選育效率。試驗結果可為大圓頭蛹蟲草優良菌種選育、復壯提供參考。