發酵工程技術在食品添加劑領域的創新應用

陳震，苗馨，孔明慧，何夢凡，張俊麗，代亞峰

(信陽師范學院 生命科學學院，河南 信陽 464000)

隨著科技的進步和社會的發展，人們對食品開發領域的關注越來越多。以前，人們往往只注重于食物的數量，時過境遷，現在的人們更加重視食品的感官、味道、營養與安全。因此，目前有很多的食品都使用了大量的添加劑，而這些添加劑的來源及安全性成為了人們關注的重點?，F在的消費者們也更加注重健康的飲食習慣，追求天然的食品成分，但是僅僅依靠天然萃取獲得的食品添加劑遠遠不夠人們所食用。當下，有一種技術可以生成與天然萃取一樣健康的成分，這就是發酵工程技術。盡管許多人知道發酵可以生產醋、豆瓣醬、啤酒、奶酪及味精等傳統產品，但很少有人知道它還可以創造出其他新的食品成分?，F代發酵工程技術與傳統發酵不完全相同，現代發酵工程技術生產者不向發酵材料中直接接種起始生物，而是將目標基因直接插入宿主生物中，然后利用發酵培養基培養目標生物并生產副產品成分，生產者可以從發酵物中提取目的成分并純化以供使用。發酵工程技術運用于食品開發領域，可以充分發揮出發酵工程的魅力，不僅豐富了發酵產品的種類，而且提升了食物的口感與品質，減少了食品添加劑的制作難度，更能夠消除人們對食品添加劑的恐慌。隨著科技的持續發展，發酵技術在食品添加劑領域一定會大有作為。本文介紹了幾種常見的食品添加劑，并逐一介紹了發酵工程技術在其中的創新性應用，為今后利用發酵工程技術生產新型食品添加劑的研究提供了參考。

1 著色劑

能夠使物質顯現出設計所需要的顏色的物質被統稱為著色劑。在食品行業，著色劑又經常被叫作食用色素，常被用來給食物染色，改善食品的色澤，使得食物的外表顏色更加符合人們的需求。通常情況下食用色素分為兩大類：天然色素和人工合成色素[1]。

大豆血紅蛋白是一種存在于豆科植物根瘤中類似哺乳動物血紅蛋白的一種紅色色素，它原本是根瘤中類菌體呼吸作用和固氮作用的協調劑。血紅蛋白是血液中攜帶氧氣的分子，用于氧氣運輸呼吸和其他代謝功能，在我們所食用的食物如家禽、肉、魚制品由大都有血紅蛋白的存在，肉類中的血紅蛋白賦予了肉類獨特的口感，因此血紅蛋白可用于肉制品的加工[2]。為了滿足全球對肉類的需求以及減少對環境的影響，Impossible Foods將大豆血紅蛋白這種植物來源的“血紅素”用于人造肉的染色，使人造肉的外觀、口感接近真正的肉類。2019年，美國食品藥品管理局已批準大豆血紅蛋白作為碎牛肉類似產品的色素添加劑。

固氮植物(例如大豆或豆科植物)會自然產生血紅素并將其存儲于根部，從這里可以提取一定的大豆血紅蛋白，但是其成本會變得非常高，而且也會造成環境的破壞。目前，已經實現了大豆血紅蛋白的發酵生產，通過發酵生產的大豆血紅蛋白可以使人造肉變紅，并讓其口感更加接近真實的肉。Jin Y等[3]通過基因工程和發酵酵母生產天然存在于植物中的血紅素蛋白，他們將大豆植物中編碼合成大豆血紅蛋白的LegHb基因插入酵母宿主菌Pichiapastoris(現在重新分類為Komagataellaphaffii)進行表達，然后通過酵母細胞發酵產生大豆血紅素。實驗結果表明，純化得到的畢赤酵母菌株中表達的LegHb 蛋白質純度大于65%，以這種方式生產的大豆血紅蛋白已經在基于植物的肉制品中進行了測試，濃度高達0.8%。安全測試結果表明，添加畢赤酵母發酵生產的重組大豆血紅素的食品不太可能對消費者產生不可接受的過敏性或毒性風險。通過微生物發酵法獲得的大豆血紅蛋白，未來將在人造肉及其他食品領域中發揮更大的作用。

2 甜味劑

能夠賦予食品甜味的食品添加劑通常被稱為甜味劑。 甜味劑通常具備以下幾特點：引起的味覺良好、安全性高、穩定性好、水溶性好、價格合理。甜味劑在很多食品中均有一定的應用，比如：增強食物的甜度、使食物形成一定的風味，對風味的調節和增強。適量地使用甜味劑可以使產品獲得良好的口感，又能使食物保持新鮮的味道。

甜菊糖，俗稱甜菊糖苷(stevioside)，是一種植物無熱量代糖品，它是從菊科植物甜葉菊的葉子中提取出來的一種糖苷，甜葉菊的葉含有甜菊醇糖苷的混合物，并在南美用作天然甜味劑已有數百年歷史。甜菊糖苷的安全性已通過對其分解代謝及其作為食品添加劑的用途的研究得以確定，從而使其在美國和歐盟得到普遍使用。甜菊糖苷由二萜類甜菊醇骨架組成，在骨架上飾有1～3個葡萄糖。甜菊糖的甜度是蔗糖的200～350倍，但熱量卻只有蔗糖的1/300，甜菊糖的甜度高、熱量低，是一種基本不會在人體內殘留的天然食品添加劑[4]。因其熱量較低，甜菊糖可以用來制作一些低熱量的食品供給一些特殊人群(如糖尿病、肥胖人群、三高患者)食用。此外，甜菊糖苷具有獨特的清涼、甘甜特點，可以用來制作糖果，也可用作矯味劑，抑制一些藥物或者食品的怪味和苦味。

在所有糖苷中，五糖苷Reb D是最甜的，且苦味低，六糖苷Reb M具有高甜度、快速和干凈味道的特性，因此Reb D和Reb M是目前最優質的高潛力的天然甜味劑。但是Reb D和Reb M只存在于甜葉菊葉中，且含量非常低(約占干重的 0.4%～0.5%)，這使得從甜葉菊植物中純化這兩種化合物用于工業用途不切實際且成本高。編碼SGs包括Reb D和Reb M生物合成的基因已被篩選鑒定，SGs的合成途徑已成功在釀酒酵母中表達，酵母微生物提供了Reb D和Reb M的異源生產替代場所[5]。因此，可以通過酵母發酵來生產存在于甜葉菊葉片中的Reb M和Reb D分子，有望借助微生物發酵技術實現商業化大規模生產下一代甜葉菊甜味劑，據調查，預計到2025年，發酵法生產的高強度甜菊糖甜味劑市場將超過30億美元。

3 營養強化劑

營養強化劑是指為了增強營養價值而向食品中加入的天然或者人工合成的屬于天然營養素范圍的食品添加劑，這種經過添加的食品也被稱為強化食品。食品營養強化劑是一類重要的食品添加劑，用于補充人體部分營養素，在食品中添加營養強化劑可以增強食物的營養成分，增加人們因某些原因所缺少的部分營養，增強身體素質，并將影響人們身體健康的風險降到最低。營養強化劑的作用不僅僅是減少疾病、調節健康，借助營養強化劑預防疾病甚至治療某些疾病已經成為營養強化劑發展的新方向。

維生素K2是應用最早的一種營養強化劑，它能夠有效地預防血管鈣化和骨質疏松以及一些癌癥的發生，同時能夠補充身體內的蛋白質，它不但能夠促進凝血酶原的形成，加速凝血，保證凝血的正常，還能夠有效地幫助骨頭和血液保持正常。維生素K2在食品中的含量極少，但也是人體所必需的一部分 ，維生素K2有著“鈾金維生素”之稱，同時維生素K2也被廣泛用于醫藥工業中。

維生素K并非是一種單一的物質，而是一類具有醌類結構的脂溶性化合物。維生素K主要分為兩種：第一種是維生素K1，也被稱為葉綠醌，其主要來源于植物中；第二種即維生素K2，主要是微生物代謝產生的，最初來源于納豆。維生素K2，常態為淡黃色粉末狀。通常腸道內的細菌可以合成維生素K2，一般不會引起缺乏，但當大量使用抗菌素，腸道細菌不能合成維生素K時，會引起缺乏癥。維生素K2是一類具有相同2-甲基-1,4-萘醌環不同長度側鏈的系列衍生物，由于異戊二烯側鏈在C-3上的長度不同，維生素K2可以分為14種，分別以MK-n表示(其中n表示側鏈異戊二烯單位數)。其中，MK-7是維生素K2中最具生物活性形式的。

以前，人們主要從奶酪和日本納豆等食物中獲得維生素K2，但維生素K2在食品中含量非常少，因此通過細菌發酵是天然產生該活性成分的最好方法。然而MK產量較高的菌種不多，目前主要利用枯草桿菌(Bacillussubtilis)[6]來發酵生產MK-7。Natto Pharma公司利用具有高生產能力的芽孢桿菌，并以蔬菜基質來發酵生產MK-7，經提取純化和濃縮后，可獲得不含已知過敏原的優質活性成分。目前，對微生物法生產維生素K2的研究主要體現在菌種的誘變和發酵條件的優化上。Yoshinori 等[7]利用紫外和亞硝基胍結合的誘變方法，篩選得到一株BacillussubtilisOUV23481高產菌株，其產量高達1719 μg/100 g，是出發菌株產量的2倍。最近，Novin等[8]利用牛奶作為培養基發酵Bacillussubtilisnatto生產維生素K2，經過條件優化后，制備得到一種富含MK-7(3.54 mg/L)的乳制品。國內方面，杜亞飛等[9]對納豆芽孢桿菌進行DES誘變和紫外誘變，篩選得到維生素K2高產的營養缺陷型菌株，并通過響應面優化，產量最終達到51.23 mg/L。

4 功能性食品添加劑

目前的研究結果表明，大多數食品除了自身具有營養功能和感覺功能外，還具有調節高級生命活動的功能，具備該特性的食品又被稱為功能食品，而其中的有效成分則能稱為功能性食品成分。這些功能成分具有生理活性，它們可對體內固有的生理調節因子發生刺激作用，或與體內的特定組織器官發生作用，使其功能增強或受到抑制，從而對生命活動進行調節。

蝦青素(蝦紅素)，是一種橙紅色脂溶性的類胡蘿卜素，易溶于有機溶劑中，具有較強的天然抗氧化性，被稱為“超強維生素”，是迄今為止人類發現的自然界中最強的一種抗氧化劑。在自然界中，蝦青素大都存在于微生物(如酵母、微藻、細菌)、甲殼類動物(如蝦、蟹等)、魚類和一些鳥類的體內[10]。蝦青素具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等生物學功能，因此具有廣闊的開發潛力，在化妝品、保健品、醫藥、水產養殖和飼料添加劑等方面均具有很大的利用價值和發展潛力，常被作為功能性食品添加劑用于食品、保健品或藥品中，對改善人類健康具有切實意義。同時，蝦青素還具有提高水產動物產卵率、促進生長和抗病防病的效果。在過去，人們主要從甲殼類動物中提取蝦青素，但是其經濟和環境成本較高。蝦青素也可通過化學合成的方法獲得，但化學合成蝦青素費用昂貴，且多為順式結構，與天然蝦青素不同?，F在，人們更傾向于利用酵母發酵的方法來生產蝦青素，這種方法具有易操作、環境友好、成本低等優勢，且蝦青素提取后的菌體單細胞蛋白可作為飼料添加劑，是一種極具產業化前景的天然蝦青素生產方法。Nextferm Technologies公司利用酵母發酵生產的蝦青素與藻類來源的蝦青素相比，該蝦青素具有略微不同的微型結構，能夠被迅速有效地吸收，從而提高其生物利用度，其功效是其他蝦青素的4倍。目前，對于蝦青素的發酵研究主要集中于蝦青素高產菌株的篩選和改造上，其中紅發夫酵母生產蝦青素產量較高，是實現蝦青素工業化生產的途徑之一[11]。

EPA與DHA是兩種人體必需的多不飽和脂肪酸，一般存在于海藻和深海魚類的脂肪中。EPA和DHA對人體的健康有著重要的意義，EPA可以預防心血管疾病、免疫性疾病、牛皮癬、風濕病和腸道疾病等[12]，而DHA能夠治療抑郁癥、保護視力和促進嬰幼兒腦部發育[13]。目前，EPA和DHA的主要來源仍然是魚油，但是魚油的質量受到魚的種類、捕捉季節和捕捉地域的限制，魚油成分復雜、異味重，純化成本非常高，這大大阻礙了EPA和DHA的大規模生產和商業應用的發展。研究發現，微生物包括藻類、海洋細菌和真菌，都能合成EPA和DHA等不飽和脂肪酸。微生物發酵法生產的EPA和DHA具有穩定性較好，可以人為控制，更易于分離純化和工業化等優點，這也是近年來研究的熱點。其中，裂殖壺菌可通過異養繁殖生長，其生長繁殖快，耐受機械攪拌，適宜發酵罐大規模培養。美國Martek公司已成功利用裂殖壺菌生產DHA，生物量干重可達到170～210 g/L，其中脂質占50%[14]。目前，該菌已被用于DHA的工業化生產，其細胞油脂含量高，其發酵產品的生產不受季節影響，無毒物污染，成分穩定，并已被美國及歐洲有關食品權利機構批準添加至相關食物中使用。國內外常見的裂殖壺菌生產的多不飽和脂肪酸主要以DHA為主，產量在0.33～41.3 g/L之間，而生產EPA較少，這一方面的研究工作還有待加強。

5 多糖類食品添加劑

生物多糖是由通過糖苷鍵連接的長鏈單糖單元組成的高分子碳水聚合物，天然產物中多糖的結構復雜，支鏈結構多樣，但其主鏈的基本結構通常是葡聚糖、木聚糖、果聚糖、半乳聚糖及甘露聚糖等，或者是兩種或多種單糖的聚合物，根據聚合度和分子量不同，可分為低聚糖和高聚糖。越來越多的研究[15-16]表明許多生物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂和提高免疫力等功效，可以當作營養強化劑來增強食品的功能，在食品工業中還可以作為增稠劑和保鮮劑使用，此外生物多糖還能防止淀粉老化，改良淀粉品質。因此，生物多糖的提取及生產技術的研究日益受到廣泛關注。生物多糖在自然界中廣泛存在，可從高等植物、真菌、藻類和細菌等中獲得。從植物中直接提取分離的多糖純度和效率較低。目前，微生物發酵技術已成功用于發酵生產細菌和真菌多糖，也有利用微生物發酵技術促進生物多糖的釋放及生物活性。

靈芝是一種名貴的食藥用真菌，在食品中的應用非常廣泛，不僅可以作為藥品和功能性保健食品使用，還可作為添加劑被制作成各種功能性復合調味品，如靈芝醬油和靈芝醋等[17]。作為靈芝最重要的藥理活性成分之一，靈芝多糖具有重要的生物學功能，除了具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等生物活性外，還具有免疫調節、降血糖等藥理作用，傳統栽培的靈芝容易受到環境、栽培方式等因素的影響，且生長條件難以控制，導致質量差異較大，子實體中活性成分質量不穩定，而且生產周期較長，靈芝栽培成本較高。隨著生物技術的不斷發展，目前具有操作簡單、周期短、可大規模生產等優點的液體發酵技術已被廣泛應用于靈芝多糖的生產。Feng J等[18]利用液體深層發酵技術對靈芝菌絲體進行發酵生產靈芝多糖，并通過中心復合試驗設計法對其發酵培養基進行優化，在5 L和50 L發酵罐中，靈芝多糖的產量分別高達2.59，2.65 g/L，有效地提高了靈芝多糖的產量，且獲得的靈芝多糖具有良好的免疫活性，優化后的發酵工藝可以用于靈芝多糖的大規模生產。

鐵皮石斛是另外一種重要的藥材，具有極高的藥用和食用價值，也被廣泛用于調味品如醬油、調味汁和料酒中，以增強調味品的營養，而鐵皮石斛多糖的含量和活性決定了鐵皮石斛的品質。微生物具有豐富的酶系，能夠分解轉換物質并且合成次級代謝產物。鐵皮石斛的成分和結構復雜，使得其活性物質尤其是多糖被包裹，藥性不能得到完全釋放。通過微生物發酵技術可以破壞鐵皮石斛的細胞壁，促進中藥活性物質的釋放， 提高多糖的提取率，此外微生物還可以通過代謝提高多糖的生物活性。王丹等[19]利用不同的微生物對鐵皮石斛水提液進行純種發酵，發現微生物發酵可以降低鐵皮石斛多糖的分子量，并且可以提高鐵皮石斛的抗氧化活性和體外降血糖活性，為純天然綠色鐵皮石斛的多糖研制成降糖保健品奠定了基礎。

水蘇糖是一種天然存在的功能性低聚糖，能夠增殖腸道益生菌，抑制腐敗菌生長，具有促進腸道蠕動的作用，同時水蘇糖還能保護肝功能，增強機體免疫力，可以作為一種新型食品添加劑使用。從天然原料中直接提取的水蘇糖產品純度較低，限制了它的應用。舒丹陽等[20]以草石蠶糖液為原料，利用混菌發酵技術生產高純度水蘇糖，精制純化后的水蘇糖含量高達78.13%，為高純度水蘇糖的大規模生產和應用提供了理論和實踐指導。

6 結論與展望

發酵是一個非常復雜的生物過程，需要無懈可擊的衛生措施和嚴格精密的條件控制，以確保所需的微生物能夠不受有害微生物的影響，并且滿足人類的生產要求，隨著科技水平的快速提升，發酵工程技術也得到了不斷的發展。總體來說，相比直接提取和化學合成法，發酵能產生更高質量和高純度的成分，而且發酵過程是安全可控、可追溯的，相信發酵生產的食品原料能夠得到大多數消費者的認可。

隨著社會的進步，人們也愈發注重食品的質量與安全問題，食品添加劑在人們的生活中也更為常見，利用發酵技術生產食品添加劑已經十分廣泛。另外，隨著基因工程的發展，人們可以有針對性地將目的產物的基因導入到枯草芽孢桿菌或者酵母這些安全的宿主菌中進行表達，再結合發酵工程技術來生產相應的食品添加劑，不僅能夠提升食品的開發效率，同時也能夠保障食品的品質。相信在未來運用發酵工程技術能夠安全有效地生產出越來越多的新型食品添加劑，而食品也會變得越來越健康、美味。