水稻稻瘟病抗性基因在抗性育種中的研究進展

韓雪琴，沈文娟，張振海，田 雷，羅成科，楊淑琴，李培富，張銀霞

(1.寧夏大學農學院,銀川 750021，2.寧夏回族自治區原種場，銀川 750200,3.寧夏農林科學院農作物研究所，銀川 750105)

0 引 言

【研究意義】水稻(oryzasativa)是全世界第二大糧食作物[1]。病害是影響水稻生產最重要的限制因素，其中稻瘟病作為水稻的三大病害之一，影響著水稻的高產、穩產和優質。稻瘟病是由真菌(magnaportheoryzae)引起的一種極具破壞力的真菌性病害，多樣化程度高，具有流行性、突發性、毀滅性的特點。在適宜溫度和高濕條件下，水稻產區造成的產量損失在30%～50%[2]，在發病嚴重的時候，造成水稻顆粒無收。常規育種只是通過植株的表型和調查植株的抗性鑒定相結合的方法選育抗病品種，這樣的選育不能使多基因聚合，并且選育的品種不具有廣譜和持久的抗性，不能有效控制病害的發生。采用化學防治方法來控制稻瘟病，雖然可以發揮一定的作用，但對環境的污染逐漸加重，并且嚴重影響著水稻的優質特性，不能從根本上控制病害的發生。生產中采用種植含有廣譜持久主要抗病基因的抗病品種是控制病害的發生最為經濟有效且環保的方法，而廣譜持久抗性基因的挖掘和鑒定是前提條件。研究水稻稻瘟病抗性的研究進展，對水稻抗性育種有重要意義。【前人研究進展】已有大約100個抗性基因被鑒定出和500個抗病基因相關的數量性狀位點[3]，在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個基因被成功克隆[4]。【本研究切入點】研究以水稻稻瘟病抗性的機理，抗性基因的定位、克隆，以及抗性基因在抗性育種中的應用研究近況進行綜述。【擬解決的關鍵問題】匯總和對比分析國內外的相關文獻，分析不同抗性基因在水稻抗稻瘟病中的應用研究進展，綜述水稻抗稻瘟病基因的研究現狀及前人利用抗稻瘟病基因進行抗性育種的最新研究結果，分析已克隆抗稻瘟病基因在水稻抗性育種應用中存在的問題及前景，為現階段的抗稻瘟病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

查閱國內外相關文獻以及國家水稻數據中心，收集與水稻稻瘟病抗性基因有關的研究報道。

1.2 方 法

整理匯總，從水稻稻瘟病抗性的機理，抗性基因的定位、克隆，以及抗性基因在抗性育種中的應用的研究近況進行綜述。

2 結果與分析

2.1 水稻稻瘟病抗性機理的研究與應用

2.1.1 基因對基因假說

基因對基因假說(gene for gene hypothesis)最早是由Flor在研究亞麻與銹病之間的互作時提出的假說[5]。后來Jia等[6]在水稻抗病基因與稻瘟病菌無毒基因互作中也發現了該假說，揭示了水稻和稻瘟病菌之間特性識別和互作關系。該假說認為，寄主本身具有抗病基因(R)和感病基因(S)，病原菌本身具有無毒基因(AVR)和有毒基因(VIR)。當攜帶有毒基因的病原菌侵入含有感病基因或不含有抗病基因的寄主時，寄主會感病，這種感病反應稱為親和反應。相反，當攜帶無毒基因的病原菌侵入含有抗病基因的寄主時，寄主會抗病，這種抗病反應稱為不親和反應。這種親和和不親和性主要取決于寄主與病原菌之間有無親和互作關系。例如，Pi-ta與AVR-Pita互作是第一對被鑒定的水稻R蛋白與稻瘟病菌無毒蛋白AVR間的互作對，Pi-ta編碼產物的蛋白類型為NBS-LRR,其LRR結構域能與無毒蛋白AVR-Pita在酵母細胞中直接互作[7]。

2.1.2 防衛假說

防衛假說是由Vander和Jones對基因和基因假說的繼承和發展[8]。在基因和基因假說中認為，R基因編碼的R蛋白和病原菌無毒基因編碼的Avr蛋白之間發生相互作用。但在該假說中認為，寄主體內存在一個可以讓病原菌和寄主互相識別的蛋白，這種蛋白會先與病原菌的毒性Avr蛋白結合，然后吸引寄主內相對應的R蛋白，R蛋白與Avr蛋白相互識別并形成一種能識別信號的特殊結構，最后誘導防衛基因的表達。在擬南芥的RIN4蛋白參與的丁香假單胞菌抗性反應中就對這種假說有直接的證據，RIN4蛋白會分別與NBS-LRR抗性蛋白RPM1和RPS2形成獨特的復合體，啟動一系列信號的反應，參與其免疫反應[9]。在正常情況下，1對Pik-h抗病蛋白是處在非激活狀態下的，但當病原菌侵入后，寄主植物的防御系統就會被打破，這時的識別效應子Avr-Pik-h的抗性蛋白Pikh-1就會通過改變構象激活抗病蛋白Pikh-2，由Pikh-2傳遞相關的信號來激發防御反應[10]。

2.1.3 水稻稻瘟病抗性基因

水稻的抗性基因有2類，分別為主效抗性基因和微效抗性基因[11]。抗稻瘟病基因的抗性分為2種，1種是垂直抗性和水平抗性[12]，垂直抗性也叫完全抗性，一般由1～2個主效抗性基因控制，但少數的主效基因是由隱性基因或不完全顯性基因控制，屬于質量性狀；帶有這類抗性基因的水稻和病原菌之間有不親和的互作方式，菌株的專化性強，寄主會隨著菌株的變異而喪失抗性。例如，地谷的主效抗稻瘟病基因Pid3對我國稻瘟病生理小種Zhong-10-8-14表現出較強的抗性[13]。另一種是水平抗性也叫部分抗性，一般由多個微效抗病基因共同控制水稻對稻瘟病的抗病性，屬于數量性狀；帶有這類抗性基因的水稻和病原菌之間有親和的互作方式，對不同的稻瘟病生理小種都表現出抗性，使菌株的專化性變弱，使水稻具有持久的抗性。例如，Pb1是在秈稻品種mudan中克隆得到，但該基因只在水稻成熟階段表現出較有效的抗性，尤其是對水稻的穗頸瘟[14]。

2.2 水稻稻瘟病抗性基因的定位

Sasaki通過人工接種的方法，確定了日本水稻品種中有1個顯性抗病基因[15]。1965年，Goto Yamasaki對稻瘟病進行了系統性的分類研究。1966年，Kiyosawa等定位到了第一個抗性基因pia[16]；到1981年，他再次定位到了8個位點上的14個稻瘟病主效顯性基因，分別為pik位點上的pikh、pikm、pikp、piks；pita位點上的pita、pita2；pikz位點上的pikz、pizt以及pia、pish、pib等[17]。1991年，Yu等在12號染色體上定位到了pi-6(t) 基因，還有pi-1(t)、pi-2(t)、pi-4(t) 等基因[18]。1994年，Mew等在Yu的基礎上對這3個基因進行了更加精密的定位[19]。同年，Wang等[20]定位到了2個抗性基因，分別為pi-5(t)和pi-7(t) 。而中國對稻瘟病抗性的研究較晚，在1976～1979年才完成了全國稻瘟病生理小種的鑒定，為稻瘟病的研究奠定了基礎[21]。1994年，朱立煌等[22]在8號染色體上定位到了pi-zh，這也是第1次在8號染色體上發現抗病基因。之后又在8號染色體上定位到了pi33、pi-11、pi-GD-1基因，在11號、6號、12號染色體上定位到了pi-1、pi-2、pi-4等基因，其中pi-1是第一個定位在11號染色體上的基因。2001年，朱獻豐等[23]在12號染色體上定位到了pi6基因。2002年，吳金紅等[24]在Mew的基礎上對pi-z(t) 進行了精確定位。2003年，Berryer等定位到了位于8號染色體上的pi-33(t) 基因[25]。近年來，隨著分子生物學的快速發展，已有大約100個抗性基因被鑒定出和500個抗病基因相關的數量性狀位點[3]。表1(http://archive.gramene.org)

表1 已鑒定的稻瘟病抗性基因Table 1 Rice blast resistance genes identified

2.3 水稻稻瘟病抗性基因的克隆

通過使用圖位克隆法，在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個基因被成功克隆[4]。其中Pita和pib是最早被克隆出來的基因[26,27]，而pib是第一個克隆出來的主效抗瘟基因，它位于2號染色體上[27]。Pi9是第一個廣譜抗瘟基因被克隆出來[28]。Pi21是第一個被克隆出來的部分抗性基因[29]。Bsr-d1是近期克隆的部分抗性基因，是從廣譜持久抗病的材料地谷中發現的[30]。Zhao等[31]鑒定出了一個結構新穎的廣譜抗病基因ptr，ptr的廣譜抗性不依賴pi-ta，但pi-ta的廣譜抗性依賴ptr。這些基因不均勻的分布在各條染色體上，其中11號和6號占多數，分別占35.13%和24.32%。而5號、7號、10號染色體上暫時沒有克隆出有關基因。已克隆的稻瘟病抗性基因中有33個屬于NBS-LRR蛋白類型，其中，pi-b屬于典型的NBS-LRR類抗性基因，編碼產物為細胞質蛋白；Bsrd-1基因編碼的蛋白類型為MYB轉錄因子；Pi-21基因編碼的蛋白類型為富含脯氨酸蛋白；Pid-2基因編碼的蛋白類型為類受體激酶蛋白；ptr基因編碼的蛋白類型為膜蛋白。其中19個基因具有葉瘟抗性，pi-25基因對葉瘟和穗頸瘟都具有抗性；pi-63和pid-3對整個時期的稻瘟病都具有抗性，占已克隆的稻瘟病抗性基因的5.4%；pb1在水稻成熟階段具有較有效的抗性，對穗頸瘟具有很好的抗性。表2

表2 已克隆的稻瘟病抗性基因Table 2 Cloned blast resistance genes in rice

2.4 水稻稻瘟病抗性基因在育種中的應用

2.4.1 常規育種

常規育種的方法是通過有性雜交，利用田間農藝性狀選擇和抗性鑒定相結合，將抗病基因導入目標株系育成抗病品種。常規育種從選擇親本開始，利用單交、復交、回交的手段，將抗稻瘟病基因重組到一個新的品種中去。例如，可以選用品質優、產量高但不抗病的品種和抗病但不具有此優點的品種作為親本，來選育新的抗病優質高產品種。在抗病育種中，導入的抗病基因的遺傳傳遞能力要強、抗譜性要廣，導入的抗源材料親和力要強，這樣才能容易有效的把抗病基因導入新的品種中。目前，常規育種仍然是水稻抗稻瘟病育種中比較有效的方法。但此方法是通過田間抗性鑒定為依據，田間不同的抗性基因會出現交叉相掩蓋現象，只能選擇1個或2個抗性基因，不利于多基因聚合的選擇，很難實現選育的新品種具有廣譜抗性和持久抗性。

2.4.2 分子標記輔助選擇育種

分子標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)是將分子標記應用于作物育種中的一種選擇輔助手段。該方法是利用與目的基因緊密連鎖或基因本身的分子標記來選擇基因型，在分子水平上確定材料的基因型，同時還可以對全基因組進行篩選，來減少連鎖累贅。此方法不受環境和稻瘟病病菌生理小種的影響，可以有效的提高育種的效率和準確性，還可以在短時間內選育出具有持久抗性的水稻品種。近年來，研究者利用此方法開展了稻瘟病抗性育種，并且取得了實質性的進展。

分子標記輔助育種的前提是利用分子標記對稻瘟病基因型進行檢測，對品種的抗性進行針對性的改良。最初是通過回交的方法，將供體中的目的基因滲入到受體中，但隨著目的基因的滲入，與目的基因連鎖的其它基因也會滲入到受體中，形成“連鎖累贅”。分子標記輔助選擇必須應用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的標記，可以在目的基因附近發生重組個體，比較理想的是標記離目的基因5cM，這樣選擇到的目的基因植株的正確率在99.75%以上[60]。李仕貴等[61]應用與稻瘟病抗性基因pi-d(t) 緊密連鎖的微衛星標記RM262對含有該抗病基因的品種地谷與感病品種江南香糯8987的F2群體進行MAS選擇，結果表明，應用該標記的抗性重合和雜合帶型選擇抗性植株的準確率在98%以上。文紹山等[62]利用與抗稻瘟病基因pi-9(t) 緊密連鎖的分子標記pB8對育種后代進行檢測，篩選到攜帶有pi-9(t) 基因的恢復系新株系。

分子標記輔助選擇在基因聚合育種方面也有著廣泛的應用，在基因聚合育種中，應用目標性狀緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，即將多個不同抗性基因聚合到1個新的品種中，這樣可以打破回交育種中只能改良個別性狀的局限性，可以使品種的多個性狀得到改良，提高育種的效率，縮短育種周期，得到更有價值的育種材料，并且可以有效的克服病原菌的變異。Hittalmani等利用MAS選擇將分別含有抗稻瘟病基因pi-l、pi-5、pi-ta聚合到同一品系BL24中，得到改良單株，其抗性比含有單個抗病基因的單株要強[63]。董巍等[64]通過MAS選擇的方法將稻瘟病抗病基因pi-1、pi-2回交聚合到培矮64S中，篩選到10株對稻瘟病抗病明顯增強的改良株系。

2.4.3 基因工程育種

基因工程育種是水稻稻瘟病抗性育種中最直接的方法之一，它是以抗性基因克隆為基礎，將克隆后的抗性基因經過剪切和拼接加工后，借助載體導入受體細胞中，使抗性基因融合與受體細胞中，受體細胞表達抗性，受體材料就會對稻瘟病具有抗性[65]。基因工程育種也可以將水稻基因庫中不具有的各種抗性相關基因轉入水稻中，拓寬抗病基因的來源，培育出新的抗病材料，為抗病育種提供新途徑[66]。潘素君等[67]通過農桿菌介導法將廣譜抗稻瘟病基因Pi-9轉入5個秈稻品種，接種鑒定表明，轉基因植株具有很強的稻瘟病抗性。以抗稻瘟病的粳稻中花9號轉溶菌酶基因材料 D2-1-2 與秈型雜交稻兩優培9的恢復系 9311 及不育系培矮64S、汕優 63 的恢復系明恢 63 分別雜交和多代回交，進行外源溶菌酶基因的轉育。結果表明，轉育后代抗性與輪回親本相比、測交組合抗性與對應雜交稻組合相比都有了較大提高。隨著轉育回交世代的增加，抗性增強得越明顯[68]。但此方法對實驗室的要求和對操作者的技術要求比較高，成本也較高，在實際生產中較難普及。

3 討 論

3.1 目前水稻稻瘟病抗性育種的研究大多數還停留在傳統的育種研究。這種育種方法不僅耗時長還費人費力。傳統育種出的新品種存在單一性，但病原菌變化多樣，環境條件變化多端，新品種不能有長期的抗性效果，要不斷的培育新的抗病新品種；在常規雜交育種中，對于多個抗性基因聚合時，由于不同的抗性基因間存在抗譜的交叉重疊，在后代中出現大量的假陽性現象，降低了選擇的目標性和準確性。分子標記輔助選擇育種、基因工程育種可以有效的提高抗性基因的準確性，但這些方法成本高、不利于規模化檢測，應該加強與抗性基因緊密連鎖或分離的操作簡便、成本低、方便規模化檢測的分子標記。

3.2 有些抗病品種在當地表現為抗病，但在其它地方抗病性卻表現較差，這是由于可能某些抗病基因受到環境條件和病原菌變化的影響，導致其抗病性不能順利表達有關。這就需要育種工作者對稻瘟病病原菌與水稻寄主之間的相互關系進行深入的研究，以便解決水稻的廣譜持久抗性問題。

3.3 在水稻抗稻瘟病育種中，一般攜帶抗病基因的品種，其農藝性狀表現較差，會出現分蘗少、產量低、晚熟等癥狀，這是由于受基因連鎖等因素的影響，所以打破這種不良連鎖將推動水稻抗病害育種產生質的突破。

3.4 雖然已經有很多抗稻瘟病基因被定位、克隆，并且在育種中表現出來了一定的抗性，但對大多數基因的抗性、廣譜性和持久性以及生態適應區還不清楚，有些抗病基因還未標記到。因此，還需要對抗性資源進行系統的研究，繼而通過分子標記遺傳改良水稻的稻瘟病抗性，加速水稻抗病分子育種進程。

抗稻瘟病基因在水稻育種應用上，抗性基因可操作性強、效果明顯，但這些基因在生產中的分布及利用情況尚不清楚。比如，Piz和Pik是水稻中目前報道含有廣譜高抗稻瘟病最多的2個位點，它們分別包含pi2、pi9、pizt和pi1、pikh、pikm等復位基因[69-71]。另外，pita和pib對我國很多稻區也表現出很高水平的抗性[72-73]。但這些位點或基因的分布及利用上還缺乏完善的研究，限制了它們在育種中的應用。

4 結 論

已有大約100個抗性基因被鑒定出和500個抗病基因相關的數量性狀位點；在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個基因被成功克隆；在不同的育種方法中，基因工程育種是水稻稻瘟病抗性育種中最直接的方法。水稻稻瘟病抗性基因的鑒定是抗性育種的基礎，抗性基因的充分利用有利于快速有效的選育出新的具有廣譜和持久抗性的抗病品種。