結直腸腺癌中TKT的表達及臨床意義

張 偉，高婉婉，宋 紅，張偉璇，李佳嘉，張 帆

2018年全球癌癥報告顯示，結直腸癌約1 810萬新發病例和960萬死亡病例，位居癌癥發病率的第3位，病死率的第2位[1]。隨著經濟增長和生活水平提高，結直腸癌已嚴重威脅人類生命健康。目前，手術切除和輔助化療是結直腸癌的主要治療方法，結直腸癌中相關分子靶向治療進展緩慢，腫瘤的復發和轉移仍是導致患者死亡的主要原因。因此，迫切需要深入探索結直腸癌的分子機制，尋找有效的診斷和治療靶點。近年，腫瘤能量代謝異常引起廣泛關注。轉酮醇酶(transketolase, TKT)是戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway, PPP)非氧化階段的關鍵酶。TKT參與多種惡性腫瘤的發生、發展，如在肝細胞癌[2]、食管癌[3]、卵巢癌[4]、子宮頸癌[5]等腫瘤中均檢測出高表達。現階段TKT在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系尚不清楚。本文通過Oncomine及GEO數據庫分析TKT基因在結直腸腺癌和癌旁組織中的表達，采用qRT-PCR和Western blot法檢測結直腸腺癌組織和細胞樣本中TKT的表達量，運用免疫組化檢測結直腸腺癌石蠟組織中TKT的表達，著重探討其與臨床病理特征的相關性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年10月～2020年10月皖南醫學院第一附屬醫院/弋磯山醫院病理科行結直腸腺癌根治術的92例浸潤性腺癌及配對癌旁正常組織石蠟標本，其中男性51例，女性41例，患者年齡21～86歲，中位年齡52歲。所有病例均經兩位高年資病理醫師閱片確診。

1.2 方法

1.2.1數據庫分析 利用Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/)數據庫分析TKT在腫瘤(包括結直腸腺癌)中的表達；利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數據庫大樣本分析TKT在結直腸腺癌組織和癌旁組織中表達差異；應用GEO公共數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)分析17例結直腸腺癌組織及配對癌旁組織中TKT的表達。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR 使用TRIzol試劑(日本Takara公司)提取總RNA，根據說明書利用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。使用SybrGreen qPCR Mix(德國DBI公司)試劑盒，在ABI 7500熒光定量儀完成27例新鮮結直腸腺癌組織及配對癌旁組織的qRT-PCR檢測。以Folds=2-△△Ct表示組間相對倍比關系，以GAPDH為內參。qRT-PCR引物序列：TKT正向引物：5′-GAAGATCAGCTCCGACTT GG-3′，反向引物：5′-GTCGAAGTATTTGCCGGTGT-3′；GAPDH正向引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.3Western blot檢測 收集8例新鮮結直腸腺癌組織及配對癌旁組織，7株常見人結直腸癌細胞株(SW480、LOVO、HCT116、RKO、Caco2、SW620、DLD1)及人正常結腸黏膜上皮細胞株(FHC)。用RIPA裂解緩沖液(江蘇凱基生物公司)提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物公司)測定蛋白濃度。利用10%SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白電轉致PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%脫脂牛奶的PBST溶液中封閉1 h，加入一抗TKT(11039-1-AP)在4 ℃孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，用PBST洗滌30 min。使用ECL發光液(杭州弗德生物公司)進行化學發光。

1.2.4免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋后切片。免疫組化染色采用EliVision兩步法，兔抗人TKT(11039-1-AP)抗體購自武漢三鷹生物公司，工作濃度1 ∶200；四種錯配修復(mismatch repair deficent，MMR)蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)抗體及EliVision試劑盒均購自福州邁新公司；具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用人肝臟組織中TKT染色為陽性對照，PBS代替一抗作空白對照，DAB顯色，蘇木精復染。免疫組化判讀由兩位高年資病理醫師采用雙盲法閱片。

1.3 結果判斷TKT陽性判斷標準[6]：(1)按細胞陽性百分比進行評分：陽性細胞數<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；(2)按細胞著色強度進行評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項得分的乘積進行分組：>4分為高表達組，≤4分為低表達組。MMR蛋白判斷標準：有任何比例和強度的癌細胞核著色為陽性，癌細胞核均未著色為陰性；四種MMR蛋白均陽性為正常，任一種MMR蛋白陰性為缺失。

2 結果

2.1 數據庫分析結直腸癌中TKT的表達應用Oncomine數據庫在線分析TKT在結直腸腺癌中的表達，入選標準：TKT在腫瘤組織和正常組織間差異倍數>2、基因排位<10%、P<0.001。結果顯示：符合入選標準的數據庫有13個(圖1)，通過GEPIA工具在線分析TCGA芯片數據庫(367例結直腸癌樣本)顯示TKT表達上調(圖2A)。利用GEO公共數據庫(GDS4382/208699)分析17例新鮮配對結直腸腺癌組織中TKT表達，結果顯示：TKT在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織(圖2B)。上述分析結果提示TKT在結直腸癌的發生、發展中可能起促癌作用。

圖1 Oncomine數據庫中TKT在結直腸腺癌中的表達：藍色為表達下調；紅色為表達上調；顏色深淺為數據庫數量所占位次

2.2 結直腸腺癌中TKT mRNA表達及診斷價值應用qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌及配對癌旁正常組織中TKT mRNA的相對表達量，結果顯示結直腸腺癌組織中TKT mRNA水平比癌旁組織明顯升高，差異有統計學意義(P<0.001，圖3A、B)。利用結直腸腺癌和癌旁正常組織中TKTmRNA相對表達量制作受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)評價TKT診斷價值，結果顯示：ROC曲線下面積(area under curve,AUC)為0.877，敏感性為0.784，特異性為0.970(圖3C)。AUC越接近1越具有診斷價值，表明檢測TKT mRNA表達可以鑒別正常組織與結直腸腺癌組織，TKT具有作為結直腸腺癌診斷標志物的潛在價值。

圖2 A.GEPIA在線分析TKT在TCGA數據庫結直腸腺癌標本中表達：T.腫瘤組織；N.癌旁組織；B.GEO數據庫中TKT在結直腸腺癌與配對癌旁正常組織中的表達

2.3 Western blot法檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達Western blot法檢測8例新鮮配對結直腸腺癌組織和常見結直腸癌細胞株，結果顯示：8例結直腸腺癌組織中TKT蛋白表達明顯高于癌旁組織(圖4A)；在7株人結直腸癌細胞株(SW480、LOVO、HCT116、RKO、Caco2、SW620、DLD1)中TKT蛋白表達顯著高于人正常結腸黏膜上皮細胞株FHC(圖4B)。

2.4 免疫組化檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達92例配對結直腸腺癌及癌旁正常石蠟組織中TKT有60.9%(56/92)呈高表達，在癌旁組織中僅26.1%(24/92)呈高表達，兩組間高表達率差異有顯著性(P<0.001，圖5)。

圖3 A.qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌組織與配對癌旁正常組織中TKT表達量的倍比關系：T.結直腸腺癌組織；N.配對癌旁正常組織；B.qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌組織與配對癌旁正常組織中TKT相對表達量的比較；C.ROC曲線評估TKT的診斷價值

圖4 A.Western blot檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達：N.配對癌旁正常組織；T.結直腸腺癌組織；B.Western blot檢測結直腸腺癌細胞株及正常結腸黏膜上皮細胞株中TKT的表達

圖5 結直腸腺癌中TKT的表達，EliVision兩步法：A.TKT在直腸腺癌組織中低表達；B.TKT在結腸腺癌組織中高表達；C.TKT在直腸配對癌旁正常組織中不表達；D.TKT在結腸配對癌旁正常組織中低表達

2.5 結直腸癌中TKT蛋白表達與臨床病理特征的關系92例結直腸腺癌中，TKT蛋白高表達與腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移以及腫瘤T分期有相關性(P<0.05)，即腫瘤直徑大、有脈管侵犯、有淋巴結轉移及T分期較晚者，TKT表達率更高；TKT高表達與患者年齡、性別、分化程度、神經侵犯、發生部位及MMR蛋白表達均無相關性(表1)。

表1 結直腸腺癌中TKT表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

2011年Hanahan和Weinberg重新定義了惡性腫瘤的十大特征，腫瘤能量代謝異常是其中之一[7]。目前，研究顯示腫瘤細胞的能量代謝異常主要體現在Warburg效應和合成代謝增強等方面。快速增殖的腫瘤細胞需通過各種方式增加戊糖磷酸途徑活性來滿足自身能量供應。TKT是硫胺二磷酸依賴性酶，戊糖磷酸途徑非氧化階段的限速酶，該基因定位于3p14.3，蛋白全長623個氨基酸，相對分子質量為6.8×104，在生物進化過程中高度保守，真核生物各組織器官均有分布[8-9]。人類基因組研究還發現，TKT同家族基因轉酮醇酶樣基因1(transketolase-like1, TKTL1)和轉酮醇酶樣基因2(transketolase-like 2, TKTL2)在結構和功能上具有一定的相似性；TKTL1基因位于腫瘤和細胞周期激活基因Xq28區域，在腫瘤發生中起重要作用[8]。目前，有研究報道TKTL1在乳腺浸潤性導管癌中高表達，與腫瘤的浸潤、轉移有一定的相關性[10]。

TKT在多種惡性腫瘤中表達上調，其過表達與不良臨床預后特征密切相關。Corona等[11]對肝癌的代謝組學研究發現，與癌旁組織相比，TKT在肝癌中表達明顯上調。Xu等[2]研究顯示，與癌旁組織相比，肝癌組織中TKT mRNA和蛋白表達均顯著上升，且TKT過表達與靜脈侵犯、腫瘤衛星結節形成、癌腫直徑大和腫瘤缺乏包膜的侵襲性特征密切相關。Ogusawska等[12]研究顯示TKT過表達與腎細胞癌分期晚和生存期短顯著相關。Zhao等[4]報道，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中TKT過表達，且TKT轉錄本的過表達與漿液性病理類型及TP53突變型卵巢癌患者的無進展生存期差相關。目前，國外僅報道1篇，國內尚未見TKT在結直腸癌組織中的報道，本組在Oncomine和TCGA樣本庫的分析結果均顯示TKT在結直腸癌組織中表達上調；利用qRT-PCR和Western blot法檢測新鮮配對結直腸腺癌組織及癌旁組織和細胞中TKT mRNA和蛋白的表達，結果與數據庫一致。本組27例新鮮結直腸腺癌組織中TKT mRNA表達量顯著高于配對癌旁組織；8例新鮮結直腸腺癌組織中TKT蛋白表達顯著高于配對癌旁組織；常見結直腸癌細胞株中TKT蛋白表達顯著高于FHC細胞株。綜上所述，在結直腸腺癌組織和細胞中TKT mRNA和蛋白表達均上調。本組對92例結直腸腺癌標本進行檢測，結果顯示TKT高表達與腫瘤直徑大、脈管侵犯、淋巴結轉移及腫瘤T分期晚有相關性(P均<0.05)，TKT可能是結直腸癌預后不良因子。微衛星不穩定(microsatellite instability， MSI)是結直腸癌發生、發展中的重要分子事件，免疫組化檢測MMR蛋白是篩查MSI的重要方法[13]。謝仲鵬等[14]研究顯示MMR蛋白表達缺失與結直腸癌臨床病理特征相關。本組分析TKT與MMR蛋白表達的相關性，結果顯示61.5%(8/13)的MMR蛋白表達缺失結直腸腺癌組中TKT低表達，差異無統計學意義，但應擴大樣本進一步分析。

目前，TKT在結直腸癌中發揮促癌的作用已初見端倪，其具體分子機制尚需深入研究。Tseng等[15]報道敲低TKT可激活琥珀酸脫氫酶和富馬酸水合酶，下調HIF-1α使乳腺癌轉移受抑制。Xu等[2]研究顯示TKT經由氧化應激途徑促進肝癌進展，TKT基因敲除或TKT抑制劑(Oxythiamin)能增加肝癌細胞對索拉非尼的療效。TKT抑制劑有可能會使腫瘤患者獲益。

綜上所述，本組結果表明結直腸腺癌中TKT mRNA和蛋白水平均顯著升高，并發現TKT高表達與侵襲轉移臨床病理特征密切相關，提示其可能參與結直腸腺癌的發生、發展；TKT有望成為結直腸腺癌預后標志物或潛在的治療靶點。