lncRNA COLCA1/miR-423-5p/FAM172A分子軸對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖和遷移的影響

金 晶，皮先明，余新健，白書(shū)仙，毛慧芳，張 波

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)起源于表皮膠質(zhì)形成細(xì)胞，是我國(guó)常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。目前，CSCC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與慢性炎癥、化學(xué)致癌物、微生物感染等有關(guān)[2]。明確CSCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找關(guān)鍵調(diào)控作用分子，對(duì)CSCC的診斷和治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性RNA，自身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[3]。lncRNA可通過(guò)多種方式調(diào)控特定基因的表達(dá)，在人體多種疾病包括腫瘤的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[4-5]。COLCA1是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究顯示COLCA1在乳腺癌組織中低表達(dá)，COLCA1表達(dá)越低，乳腺癌患者的生存期越短[6]。COLCA1在CSCC組織中的表達(dá)及對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文檢測(cè)COLCA1在CSCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)CSCC細(xì)胞增殖和遷移的影響，應(yīng)用生物信息學(xué)法探討其發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年2月～2019年12月我院行手術(shù)切除的CSCC組織37例，標(biāo)本在液氮中保存并經(jīng)病理檢查確診。男性20例，女性17例，平均年齡(52.93±9.57)歲；原位鱗狀細(xì)胞癌9例，高分化鱗狀細(xì)胞癌12例，中分化鱗狀細(xì)胞癌16例。選取同期行整形外科手術(shù)的正常人皮膚組織37例作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞與主要試劑CSCC細(xì)胞系(HSC-2、SCL-12、Colo-16、A431、SCL-1)和人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。COLCA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒，均購(gòu)自上海吉瑪基因公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。qRT-PCR和Trizol試劑，均購(gòu)自北京天根生化公司。ECL試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。噻唑藍(lán)(methyl thiazol tetrazolium，MTT)和二甲基亞砜，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。一、二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HSC-2、Colo-16、A431細(xì)胞采用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，SCL-12、SCL-1、HaCaT采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí)，通過(guò)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒(對(duì)照組)和COLCA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)至A431細(xì)胞，具體操作步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RNA提取和qPCR檢測(cè)通過(guò)Trizol試劑裂解并提取組織和細(xì)胞系總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。熒光值采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)COLCA1和FAM172A mRNA的表達(dá)，以U6為內(nèi)參檢測(cè)miR-423-5p的表達(dá)。COLCA1上游引物：5′-CAGCAGCAGGGACTCAGC-3′，下游引物：5′-AGCCGGATGCTTTGTGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；miR-423-5p上游引物：5′-GGTCGCTCTCTGCCCCTCA-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；FAM172A上游引物：5′-CGACTGGCGAACTGGAAG-3′，下游引物：5′-GAGCTCAAGGAAATAGACATCAATC-3′。

1.5 MTT檢測(cè)A431細(xì)胞增殖A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天。每天進(jìn)行MTT檢測(cè)，每孔加入10 μL濃度為2.5 g/L的MTT試劑，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μL二甲基亞砜，水平振蕩器振蕩20 min，酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值，繪制A431細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A431細(xì)胞遷移A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以8×105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔。待A431細(xì)胞貼壁后，使用10 μL移液槍槍頭在6孔板底部劃痕，用PBS沖洗3次，加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下(100×)拍照并記錄細(xì)胞劃痕寬度W1。培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下(100×)拍照并記錄細(xì)胞劃痕寬度W2，細(xì)胞遷移率代表細(xì)胞遷移能力，遷移率=(W1-W2)/W1×100%。

1.7 生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)COLCA1潛在分子機(jī)制采用LncBase Predicted v.2在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)COLCA1可能互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，采用miRNA Map在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA可能互補(bǔ)結(jié)合的mRNA。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM172A蛋白的表達(dá)A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，采用5%脫脂奶粉封閉液在室溫封閉2 h，稀釋一抗FAM172A(1 ∶1 000稀釋)、Notch1(1 ∶2 000稀釋)、Hes1(1 ∶1 000稀釋)、Cyclin D1(1 ∶3 000)、C-myc(1 ∶3 000)及α-Tubulin(1 ∶1 000)，一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。加入二抗稀釋液，在室溫下?lián)u床孵育2 h，滴加ECL試劑曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 CSCC組織和細(xì)胞系中COLCA1的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，COLCA1在37例CSCC組織與37例正常皮膚組織中的表達(dá)量分別為5.71±0.78和1.01±0.20，COLCA1在CSCC組織中呈低表達(dá)(P<0.01，圖1)；COLCA1在CSCC細(xì)胞系(HSC-2、SCL-12、Colo-16、A431、SCL-1)和人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)中的表達(dá)量分別為0.64±0.07、0.39±0.03、0.16±0.05、0.77±0.03、0.56±0.07和1.00±0.01，COLCA1在CSCC細(xì)胞系中呈低表達(dá)(P均<0.01)，A431細(xì)胞中COLCA1的表達(dá)最低(P<0.01，圖2)。

圖1 正常皮膚和皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中COLCA1的表達(dá)

圖2 皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系和人角質(zhì)形成細(xì)胞中COLCA1的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染COLCA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)A431細(xì)胞中COLCA1表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染COLCA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，qRT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A431細(xì)胞中COLCA1表達(dá)量分別為1.00 ± 0.04和9.31 ± 0.99，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中COLCA1表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01，圖3)。

圖3 COLCA1在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的A431細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)顯示，在第2、3、4、5天實(shí)驗(yàn)組A431細(xì)胞的OD值與對(duì)照組相比，其表達(dá)下調(diào)(P<0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.01)；提示過(guò)表達(dá)COLCA1可抑制A431細(xì)胞的增殖(圖4)。

2.4 過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)A431細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中A431細(xì)胞遷移率分別為(27.69±2.15)%和(61.84±6.32)%，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組(P<0.01，圖5)；提示過(guò)表達(dá)COLCA1可抑制A431細(xì)胞的遷移。

圖5 A.過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)A431細(xì)胞遷移的影響；B.直方圖統(tǒng)計(jì)分析

2.5 生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)COLCA1潛在分子機(jī)制采用LncBase Predicted v.2在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)COLCA1可能與miR-423-5p互補(bǔ)結(jié)合，采用miRNA Map在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-423-5p可能與FAM172A mRNA互補(bǔ)結(jié)合(圖6)。

圖6 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)COLCA1潛在分子機(jī)制

2.6 過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)A431細(xì)胞中miR-423-5p和FAM172A mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR檢測(cè)顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的A431細(xì)胞中miR-423-5p表達(dá)量分別為1.00 ± 0.05和0.20±0.05，實(shí)驗(yàn)組中miR-423-5p表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01，圖7)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的A431細(xì)胞中FAM172A mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.02和5.11±0.79，實(shí)驗(yàn)組中FAM172A mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)；提示過(guò)表達(dá)COLCA1可下調(diào)miR-423-5p mRNA的表達(dá)，上調(diào)FAM172A mRNA的表達(dá)。

圖7 miR-423-5p(A)和FAM172A mRNA(B)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A431細(xì)胞中的表達(dá)

2.7 過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)FAM172A蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)COLCA1后，F(xiàn)AM172A蛋白表達(dá)上調(diào)，Notch信號(hào)通路蛋白如Notch1、Hes1、Cyclin D1及C-myc蛋白表達(dá)下調(diào)，Notch信號(hào)通路活化被抑制(圖8)。

3 討論

近年越來(lái)越多的研究證實(shí)lncRNA廣泛參與細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、衰老等各種生理和病理過(guò)程[7-8]。lncRNA在絕大多數(shù)腫瘤中均異常表達(dá)，可作為抑癌基因或原癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的lncRNA與CSCC的惡性表型有關(guān)[12]。lncRNA LINC00520在CSCC組織中表達(dá)下調(diào)，LINC00520可通過(guò)干擾PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，抑制CSCC的進(jìn)展[13]。lncRNA PRECSIT在CSCC組織和細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，PRECSIT可被p53蛋白負(fù)向調(diào)控，沉默PRECSIT可抑制CSCC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14]。COLCA1是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在乳腺癌中異常低表達(dá)，與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，提示其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用[6]。目前，COLCA1在CSCC中的生理功能和分子機(jī)制尚不清楚。

圖8 過(guò)表達(dá)COLCA1對(duì)A431細(xì)胞FAM172A蛋白表達(dá)的影響

本組qRT-PCR檢測(cè)顯示，COLCA1在CSCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，提示COLCA1可能參與調(diào)控CSCC的發(fā)生、發(fā)展。MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)COLCA1可抑制A431細(xì)胞的增殖和遷移。lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與特定miRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制miRNA對(duì)其靶基因的干擾作用，進(jìn)而促進(jìn)miRNA靶基因的表達(dá)[15]。生物信息法顯示，COLCA1可能與miR-423-5p互補(bǔ)結(jié)合，miR-423-5p可能與FAM172A mRNA互補(bǔ)結(jié)合。miR-423-5p在膠質(zhì)瘤、胃癌、前列腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，miR-423-5p可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、血管生長(zhǎng)，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為患者不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)[16-17]。qRT-PCR檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)COLCA1可抑制miR-423-5p的表達(dá)，COLCA1可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miR-423-5p互補(bǔ)結(jié)合。FAM172A基因位于染色體5q15，是一類抑癌基因[18]。FAM172A在胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)AM172A表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[19]。過(guò)表達(dá)FAM172A蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，沉默F(xiàn)AM172A蛋白表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為[18]。本組結(jié)果顯示，COLCA1下調(diào)miR-423-5p表達(dá)后，F(xiàn)AM172A基因表達(dá)上調(diào)，提示COLCA1可能通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合miR-423-5p，間接促進(jìn)FAM172A基因的表達(dá)。Notch信號(hào)通路的異常活化可加速腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。Western blot檢測(cè)顯示，A431細(xì)胞中FAM172A蛋白表達(dá)升高后，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白如Notch1、Hes1、Cyclin D1和C-myc表達(dá)下調(diào)，提示Notch1信號(hào)通路活化被阻滯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)COLCA1在CSCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)COLCA1可抑制CSCC細(xì)胞的增殖和遷移，其潛在分子機(jī)制可能為COLCA1作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miR-423-5p競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控FAM172A基因的表達(dá)，抑制Notch信號(hào)通路的活化。本組實(shí)驗(yàn)為COLCA1在CSCC發(fā)生、發(fā)展中的功能提供理論基礎(chǔ)，有望為CSCC的靶向治療提供新分子靶標(biāo)。