探針擴增阻滯突變法與數字PCR法檢測甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因突變

荀延萍，姜燕平，傅佳儀，張仕蓉

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，約占甲狀腺癌的90%[1]。雖然目前絕大多數PTC預后較好，但仍有30%的PTC患者術后出現反復復發及遠處轉移[2]。Kimura等[3]研究發現70%的PTC可能存在分子改變，包括編碼受體酪氨酸激酶RET、神經營養受體酪氨酸激酶-1(NTRK1)基因，以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的兩個細胞內效應基因RAS和BRAF。BRAF作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路，可以調控細胞的增殖、分化以及凋亡[4]，在PTC中BRAF突變率最高，其中45%為V600E，其次為K601E和V599Ins[5-7]。BRAF V600E突變是PTC中最常見的一種遺傳改變，可能通過侵襲性行為影響腫瘤的發展，因此BRAF突變已成為一種潛在的PTC預后分子標記[8]，是目前PTC中分析和檢測的熱點。本實驗應用探針擴增阻滯突變(amplification refractory mutation system, ARMS)法和數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法檢測BRAF V600E突變，分析比較哪種方法更適用于PTC組織中BRAF V600E突變檢測。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2018年8月～2019年8月浙江省杭州市第一人民醫院存檔的PTC手術標本371例。患者中位年齡49歲，男性98例，女性273例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、組織切片后病理醫師復閱切片明確診斷，并評估腫瘤細胞含量后進行檢測。本組所有患者均知情同意。

1.2 DNA提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒(Qiagen公司生產，貨號56404)提取石蠟包埋組織樣本基因組DNA，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。并用微量分光光度計測定DNA濃度及純度，以OD260/OD280處于1.8～2.0之間，濃度均﹥10 ng/μL為合格。提取后的DNA樣品在-20 ℃條件下保存待用。

1.3 ARMS法檢測基因突變使用人BRAF基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)(北京雅康博生物公司，TB004)檢測石蠟包埋組織樣本中BRAF基因V600E點突變，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。采用引物序列：正鏈5′-CCTA AACTCTTCATAATGCTTGCT-3′；反鏈5′-AGTAACTCAGCAG CATCTCAGG-3′。利用ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)確定Ct值。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，合計40個循環，結束后采集熒光。樣品檢測結果分為陽性和陰性，其中無BRAF突變(突變位點檢測FAM通道)曲線或BRAF突變(突變位點檢測FAM通道)的Ct值>38判定為陰性；反之，有擴增且Ct值≤35判定為陽性。

1.4 ddPCR法檢測基因突變使用人BRAF基因突變檢測試劑盒(數字PCR法)(上海源奇生物公司，CB340002)檢測，按照說明書操作。采用引物序列：正鏈5′-CTACT GTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA-3′；反鏈5′-AGCCTC AATTCTTACCATCCA-3′。利用QX200 Droplet Digital PCR系統(美國BioRad公司)測定，PCR擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，合計40個循環；98 ℃ 10 min；4 ℃ 5 min。樣品檢測結果分為陽性和陰性，其中“ch1+”區的點<3個且落在“ch2+”區的點<5個被判定為陰性；反之，突變比例≥0.1%且落在“ch1+ch2-”區的點≥3個判定為陽性。

1.5 統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，應用χ2檢驗評價BRAF基因突變與PTC臨床病理特征的關系。

2 結果

2.1 ARMS法和ddPCR法檢測BRAF基因突變371例PTC標本中，ARMS法檢測BRAF基因突變陽性275例，陰性96例，突變率為74.1%(圖1)；ddPCR法檢測BRAF基因突變陽性284例，陰性87例，突變率為76.5%(圖2)。ddPCR法檢測BRAF基因突變率較ARMS略高，但兩組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 ARMS法檢測BRAF基因突變：A.陽性；B.陰性

圖2 ddPCR法檢測BRAF基因突變：A.陽性；B.陰性

2.2 BRAF基因突變與PTC臨床病理特征的關系ARMS法檢測男性患者的BRAF基因突變率為71.4%(70/98)，女性患者的BRAF基因突變率為75.1%(205/273)，差異無統計學意義(P>0.05)；年齡≥49歲組患者的BRAF基因突變率為73.5%(139/189)，<49歲組患者BRAF基因突變率為74.7%(136/182)，差異無統計學意義(P>0.05)。ddPCR法檢測男性患者的BRAF基因突變率為72.4%(71/98)，女性患者的BRAF基因突變率為78.0%(213/273)，差異無統計學意義(P>0.05)；年齡≥49歲組患者的BRAF基因突變率為77.2%(146/189)，<49歲組患者BRAF基因突變率為75.8%(138/182)，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變與臨床病理特征的關系

2.3 ARMS及ddPCR法檢測BRAF基因突變的一致性BRAF基因突變的一致性本組以ARMS法為標準，ARMS法和ddPCR法檢測結果陽性符合率為96.7%(266/275)，陰性符合率為79.2%(76/96)，總符合率為92.5%(342/371)(表2)。對于不一致的29例樣本，采用測序的方法進行重測，結果顯示其中23例為陽性樣本(ARMS法準確6例，ddPCR法準確17例)，6例為陰性樣本(ddPCR法準確6例)。因此經過校驗后ddPCR法檢測陽性準確率為97.9%(283/289)，ARMS法檢測陽性準確率為94.1%(272/289)。

表2 ARMS法及ddPCR法檢測BRAF基因突變的一致性分析

3 討論

BRAF V600E基因突變是促使PTC形成及進展的重要分子改變，與PTC的高侵襲性、復發、預后不良均密切相關。因此準確、快速地檢測甲狀腺結節中BRAF V600E基因突變情況，對于臨床醫師確定PTC復發危險程度的分級、采取合適的手術方式及制定合理的隨訪計劃均具有重要的指導價值[1]。有研究報道，應用免疫組化和實時熒光定量PCR法來評價BRAF V600E基因突變蛋白表達的靈敏性[9]，以及實時熒光定量PCR法與Sanger測序法也被用來比較檢測BRAF V600E基因突變結果的靈敏性[10]。本實驗采用ARMS和ddPCR兩種方法檢測371例PTC患者中BRAF V600E基因突變，結果發現ARMS法檢測BRAF基因突變率為74.1%(275/371)，ddPCR法檢測BRAF基因突變率為76.5%(284/371)，且兩種檢測方法均顯示PTC患者BRAF基因突變與患者性別、年齡無關；兩種檢測方法檢測BRAF V600E突變狀態的總符合率為92.5%，ddPCR法檢測突變陽性準確率為97.9%，ARMS法檢測陽性準確率為94.1%。總之，本實驗結果顯示，ARMS和ddPCR兩種方法檢測到的陽性突變具有相似的準確性。

一般來說，腫瘤組織再活檢是病理診斷的金標準，其中檢測組織中BRAF V600E基因狀態是一種可行的方法，需要一種高靈敏度、簡便的檢測方法，如ARMS、ddPCR等。有文獻報道基于熒光定量PCR的ARMS技術通過特異性探針識別EGFR突變序列，該方法具有很高的選擇性和靈敏度，可以檢測到組織樣本中DNA突變量低至1%的情況[11]。與ARMS法相比，ddPCR法是一種新技術，可直接檢測目標DNA的絕對拷貝數和相對拷貝數，并且通過對每個樣品中上萬滴微流體的快速分析，使得ddPCR在臨床檢測應用中具有可行性[12]。另外，ARMS為相對定量分析，ddPCR為絕對定量分析。在其他研究中表明，ddPCR的敏感性為0.01%[13]，ARMS的敏感性為0.1%[14]。基于上述研究，本實驗結果也發現，與ARMS法相比，ddPCR法在檢測PTC中BRAF V600E基因突變具有優勢，具有較高的精密度、靈敏度和準確性。因此，進一步證實ddPCR法更適用于檢測BRAF V600E基因突變，為PTC的診斷及判斷預后提供依據，在BRAF V600E突變患者中具有良好的應用前景，并發揮越來越大的作用。