α-硫辛酸對順鉑誘導小鼠耳毒性的保護作用

賀 禎，趙永強，孔凌霄，陳劍秋

順鉑（Cisplatin）的抗癌特性在20 世紀60 年代被發現，現已被廣泛用于許多實體腫瘤，然而順鉑在臨床化療中的不良反應如血液系統毒性、腎毒性、神經毒性、耳毒性，往往不可避免［1］。順鉑引起的耳毒性可導致雙側、進行性、劑量依賴性的感覺神經性聽力損失，聽力損失會嚴重影響患者的生活質量。盡管尚不清楚順鉑引起耳毒性的基本分子機制，但先前的研究表明，順鉑激活線粒體活性氧生成途徑，最終導致細胞死亡［2］。過量活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的產生被認為是順鉑誘導的耳毒性的主要原因，也是順鉑對DNA 的直接攻擊［3］。

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，ALA），是線粒體脫氫酶反應中不可或缺的輔助因子，可溶于水和脂質，并廣泛分布在細胞膜，細胞質和細胞外空間。Biewenga 等報道了ALA 的保護作用，他們發現ALA 可以減輕由于維生素C 和E 缺乏引起的壞血病癥狀［4］。后續的研究證明，ALA 是人體內一種效應強大的抗氧化劑，并對包括維生素C、E 和還原型谷胱甘肽等抗氧化劑有協同加成能力［5］。

筆者擬通過建立大鼠順鉑聽力損害動物模型，研究ALA 對順鉑誘導的聽力損失的影響，并推測ALA 激活的抗凋亡途徑在體外防止順鉑誘導的耳毒性的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物購自山東大學實驗動物中心健康BALB/c 小鼠40 只，重量18～22 g，耳郭反射正常，雌雄兼用，室溫下常規飲食安靜飼養。所有涉及動物的程序均符合動物實驗規定。

1.2 材料和儀器注射用順鉑 （齊魯制藥廠，國藥準字H37021356）；注射用硫辛酸 （江蘇奧賽康藥業，國藥準字H20061176）；TRITC Phalloidin 羅丹明標記鬼筆環肽 （上海翊圣生物科技有限公司，貨號：40734ES75） 小鼠8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine單克隆抗體 （Anti-8-OHdG）（abcam 公司，貨號ab48508）；GSH-Px 多克隆抗體（abcam 公司，貨號ab51948）；小鼠Bax 單克隆抗體（abcam 公司，貨號ab77566）；小鼠Bal-2 單克隆抗體（abcam 公司，貨號ab154140）。聽覺誘發電位一耳聲發射記錄使用美國Smart EP&OAE 智聽公司系統。共聚焦顯微鏡使用德國Zeiss，LSM 700。

1.3 實驗動物分組與設計使用前瞻性隨機對照實驗，隨機數字表法將動物小鼠分為以下四組：對照組、順鉑組、硫辛酸+順鉑組、硫辛酸組（每組10只小鼠，20 耳）。順鉑組小鼠給予腹腔注射順鉑4 mg/kg·d，連續5 d；硫辛酸組小鼠給予腹腔注射硫辛酸20 mg/kg·d，連續6 d；順鉑+硫辛酸組小鼠提前1 d預處理，腹腔注射硫辛酸20 mg/kg·d，在第2 天同時腹腔注射順鉑4 mg/kg·d，連續5 d；對照組僅給予腹腔注射等量生理鹽水。四組停藥后復查聽性腦干反應 （auditory brainstem response，ABR），完成ABR 檢查后處死小鼠取耳蝸用于形態學觀察及后續分子生物學實驗。

1.4 聽性腦干反應的檢查為了評估聽覺功能，筆者對小鼠在給藥前后進行了ABR 檢查。所有測試均在隔音室內進行。在進行ABR 檢查之前，參照文獻方法［6］通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉動物，將皮下針電極插入到顱頂正中皮下（+電極），乳突（-電極）和后腿（接地）中。通過揚聲器單聲道施短純聲音刺激，頻率分別為8、16 和32。從90 dB 聲壓級開始，以5 dB 的減量重復的刺激。

1.5 組織學切片和形態學分析四組動物停藥并完成ABR 檢查后，立即斷頭處死，參照文獻方法速取聽泡［6，7］。充分暴露耳蝸后，顯微鏡下刺破圓窗和卵圓窗，蝸尖鉆孔并使用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 溶液緩慢灌注小鼠內耳，將耳蝸標本用含0.10%戊二醛＋4%多聚甲醛混合液的雙固定液固定24 h，立體顯微鏡下去除骨性蝸管等結構，分離出基底膜。此步完成之后，分別制作掃描電鏡標本、免疫熒光標本及石蠟切片。（1）掃描電鏡標本置于3%戊二醛中送山東大學電鏡中心，由電鏡中心進行掃描電鏡所需的各項處理，同電鏡中心工作人員一起觀察標本并照相。（2）免疫熒光標本在4% EDTA 脫鈣24 h 后，用虹膜刀小心分離基底膜，PBS 沖洗后標本在室溫下與0.1%Triton X-100 孵育15 min，1∶40的TRITC-鬼筆環肽染色2 h，然后用PBS 洗滌3次。使用共聚焦顯微鏡鏡下觀察。（3）石蠟切片，耳蝸用梯度乙醇系列脫水，用二甲苯滲透，并在室溫下包埋在石蠟中。然后使用切片機將石蠟包埋的內耳連續切成6 μm 厚的切片，以備下一步免疫組化分析用。

1.6 免疫組化分析8-OHdG 表達石蠟切片脫蠟和干燥后，微波修復，滴加1 滴3%H2O2，室溫下孵育10 min，用PBS 洗滌5～10 min 后，將標本與小鼠8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）單克隆抗體室溫下放置2 h，用PBS 洗滌兩次，每張切片加1 滴聚合物增強劑，室溫下孵育20 min。PBS 沖洗后加1 滴酶標聚合物，室溫下孵育30 min。PBS 沖洗后將3-3'二氨基聯苯胺（DAB）色原滴到切片上，并原位放置5～10 min 以吸收色原。通過將樣本在蘇木精中保留1～2 min 來提供背景染色。

1.7 蛋白質印跡分析ABR 檢查后斷頭處死，取出耳蝸組織，每2 個耳蝸合為一份標本，放入RIPA裂解液，低溫震蕩研磨，低溫高速離心30 min。取上清液并測定蛋白含量。灌膠后上樣，SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳，轉膜，封閉，室溫孵育1 h 后，加入1∶1000 稀釋的GSH-Px、Bax、Bal-2 一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 沖洗后加入二抗（1∶1000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 沖洗，顯影，Image J 圖像分析軟件對條帶進行半定量分析。

1.8 統計學分析計量數據以（）表示。正組間兩兩多重比較使用t 檢驗，同時，對組織病理學數據進行Ridit 分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ABR 閾值偏移使用小鼠模型檢查了ALA對順鉑誘導的耳毒性的保護作用。小鼠于給藥處理前后經麻醉后測試ABR 數值，將前后2組數值相減，得出差值，即為ABR 閾值偏移以客觀評價小鼠耳蝸的聽力受損情況。對于對照組和ALA組，ABR的閾值偏移均＜5 dB，這表明正常小鼠的ALA 治療不會影響聽力。順鉑組的ABR 閾值偏移較對照組顯著上升，證實了順鉑治療會導致嚴重的聽力損失。硫辛酸+順鉑組閾值偏移明顯小于順鉑組，表明用ALA 進行的處理干預可以明顯保護聽力。見圖1。

圖1 見封三。

圖1 4組小鼠干預前后ABR 閾值偏移

2.2 形態學觀察使用共聚焦顯微鏡觀察鬼筆環肽染色后的基底膜以及電鏡下觀察形態學改變，均發現順鉑組耳蝸外毛細胞數量減少、形態改變，硫辛酸+順鉑組使用ALA 干預后較順鉑組耳蝸外毛細胞數量增加、形態恢復。具體表現為：順鉑組共聚焦顯微鏡下外毛細胞數量減少、明顯變性，硫辛酸+順鉑組外毛細胞數量明顯較順鉑組增加，細胞變性減輕；電鏡下，順鉑組耳蝸外毛細胞數目減少，形態上靜纖毛見明顯缺失、倒伏和融合，排列散亂，硫辛酸+順鉑組外毛細胞數量較順鉑組明顯恢復，外毛細胞靜纖毛僅見個別自然缺失、融合。形態學上發現順鉑對外毛細胞有明顯損害，使用ALA 后這種損害得到了明顯的保護和減輕。見圖2。

2.3 免疫組化觀察DNA 損傷為了從免疫組織化學的角度鑒定氧化性DNA 損傷，進行了8-OHdG染色。對照組或硫辛酸組均未觀察到8-OHdG 免疫陽性（圖3A、B）。在順鉑組的外毛細胞中確定了嚴重的免疫陽性（圖3C）。在硫辛酸+順鉑組中，在外毛細胞中觀察到了少量的8-OHdG 表達 （圖3D）。硫辛酸+順鉑組較順鉑組之間的8-OHdG 表達顯著降低（P＜0.05）。

圖3 見封三。

2.4 Western blot 檢測通過Western blot 檢測了GSH-Px 和Bax/Bcl-2 蛋白的表達水平。在用ALA 治療的2組中，GSH-Px 表達均較對照組明顯上調（圖4A）；順鉑處理比對照組更多地上調了Bax表達，ALA 處理的細胞顯著下調了Bax 表達 （圖4B）；順鉑處理下調了Bcl-2 的表達，ALA 處理的細胞恢復了Bcl-2 的表達（圖4B）。

圖2 小鼠模型的形態學變化

圖3 8-OHdG染色從免疫組化觀察DNA 損傷

圖4 western blot 分析GSH-Px 和Bax/Bcl-2 蛋白表達

3 討論

順鉑誘導的耳毒性臨床表現為雙側對稱性、進行性、劑量依賴性的感音神經性聽力損失［8］。筆者在該項研究中使用了ABR 測試來顯示在耳蝸中產生的功能損傷。該測試在第1 天和第6 天對所有大鼠進行了兩次測試。在所有頻率下，順鉑組小鼠的ABR 閾值均明顯高于其他三組。這表明順鉑具有耳毒性作用，可在所有研究頻率下引起聽力損失。

由于耳毒性是限制順鉑在臨床使用的不良反應之一，因此有研究報道了多種藥物的潛在耳保護作用。理想的耳保護劑必須提供可靠的保護，同時又不損害順鉑的抗腫瘤作用。在這種情況下，引起最大關注的試劑是消除ROS 的抗氧化劑。α-硫辛酸（ALA） 是一種衍生自辛酸的有機硫酸鹽化合物，被認為是最有效的細胞抗氧化劑之一。ALA 可以還原為二氫硫辛酸，是活性氧（ROS）的強抗氧化劑［9，10］。因其強大的抗氧化性能，筆者調查了α-硫辛酸（ALA）的耳保護作用。通過試驗發現ALA 本身對耳蝸細胞不會產生負面作用即無耳毒性。

順鉑誘導的耳毒性作用表現之一為外毛細胞受損。內耳中對順鉑最敏感的結構是毛細胞。耳蝸基部轉彎中的外毛細胞是受影響最大的細胞。細胞內ROS 的過度積累已被認為是順鉑誘導的細胞凋亡最強觸發因素［11］。在外源性順鉑刺激下，ROS快速釋放并在耳蝸毛細胞過度蓄積，氧化應激程度超出耳蝸毛細胞抗氧化能力，進而造成毛細胞DNA 的氧化損傷。DNA 損傷后能夠產生大量嘌呤羥基化、嘧啶羥基化的堿基修飾產物，在目前的各種堿基修飾產物，8-羥基脫氧鳥苷 （8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG） 是一種公認的能夠反映DNA 氧化損傷的標志物［12，13］。筆者對8-OHdG 免疫組化的結果表明，在順鉑組小鼠的外毛細胞中有明顯的8-OHdG 免疫陽性，而硫辛酸+順鉑組少量表達8-OHdG。

在細胞抗氧化劑系統中，谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px） 催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫等氧化陰離子發生還原反應，導致細胞內ROS 減少，即GSH 被GSH-Px 氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），阻斷ROS 細胞類脂過氧化［14，15］。有報道顯示，ALA 參與了谷胱甘肽的氧化和還原，通過幫助將GSSG 還原為GSH，維持了細胞內GSH 的水平，使其可用作GSH-Px 的底物，將過氧化氫還原為水［16］。在該項研究中，發現ALA治療干預后的小鼠耳蝸內GSH-Px 表達被ALA 高度上調。而且既往的研究表明，GSH-Px 影響抗凋亡Bcl-2 的表達及其活性，所以在保護小鼠耳蝸細胞免受ROS 誘導的凋亡細胞死亡中起著重要作用。GSH-Px 過表達通過增加Bcl-2 表達并降低Bax 表達來有效抑制凋亡信號轉導［17，18］。該研究同樣也發現使用ALA 后，較順鉑組小鼠，硫辛酸+順鉑組出現Bcl-2 表達上調、Bax 表達下調。因此，ALA 通過有效上調GSH-Px，繼而影響Bcl-2/Bax 凋亡信號通路。Bcl-2/Bax 信號通路中，Bcl-2 抑制細胞凋亡，Bax 促進細胞凋亡。

該研究結果顯示，ALA 對順鉑誘導的耳毒性具有較強的緩解作用，從而最終防止了硫辛酸+順鉑組小鼠的重大聽力損失。筆者采用8-OHdG 染色從免疫組化的角度揭示氧化性DNA 損傷是順鉑導致耳毒性的機制之一，并且發現ALA 通過支持GSHPx 活性來恢復氧化還原系統對抗氧化應激損傷。