發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)限制性因素分析及高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化

孫媛媛，崔樹(shù)茂，唐鑫，毛丙永，趙建新，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

發(fā)酵乳桿菌不僅是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢(shì)微生物，且廣泛地存在于人體腸道。2009年，它被列入了歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)的合格安全性推定(Qualified Presumption of Safety, QPS)清單，并被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration, FDA)列為“公認(rèn)的安全”(generally recognized as safe, GRAS)生物。在2011年被中國(guó)衛(wèi)計(jì)委列入《可用于食品的菌種名單》[1]。近年來(lái)，發(fā)酵乳桿菌的功能特性不斷被挖掘出來(lái)，如耐酸耐膽鹽[2]、降解膽固醇[3]、抗氧化[2]、抑菌[4-5]等，并且有多株功能性發(fā)酵乳桿菌被開(kāi)發(fā)上市[6]。

發(fā)酵乳桿菌是專性異型發(fā)酵乳桿菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中消耗糖產(chǎn)生乳酸、乙酸和CO2，底物的利用效率及產(chǎn)物抑制可能均不同于同型發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌。乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中首先受到底物抑制，碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、微量元素都是組成菌體增殖底物的關(guān)鍵內(nèi)容，其中，碳源和氮源能夠?yàn)榫晏峁┥L(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無(wú)機(jī)鹽除了提供礦質(zhì)元素外，還作為緩沖體系防止發(fā)酵液pH下降過(guò)快，微量元素作為多種酶的輔助因子參與菌株的代謝[7]。豐富的底物是菌株生長(zhǎng)的必要條件，但是底物濃度過(guò)高會(huì)使培養(yǎng)基的初始滲透壓過(guò)高，反而會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，因此乳酸菌培養(yǎng)前底物濃度過(guò)高、底物成分比例不合適及培養(yǎng)后期限制性底物的不足與消耗均是菌株生長(zhǎng)的抑制因素[8]。眾所周知，有機(jī)酸積累引起的酸抑制是乳酸菌分批培養(yǎng)時(shí)抑制菌體生長(zhǎng)的主要因素，但是通過(guò)補(bǔ)堿的恒pH培養(yǎng)可以輕松解除酸抑制[9]。已有研究表明，中性條件下酸根積累引起的滲透壓升高成為大部分同型發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌在恒pH培養(yǎng)時(shí)的主要抑制因素[8]。發(fā)酵乳桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸和乙酸對(duì)菌體的抑制是否亦是滲透壓抑制還是有酸根毒害作用需進(jìn)一步研究，且在菌株培養(yǎng)時(shí)需均衡底物和代謝產(chǎn)物濃度，既確保底物濃度不會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生抑制，又需保證底物能夠?yàn)榫w高濃度增殖提供充足營(yíng)養(yǎng)。

本文在分析底物抑制和代謝產(chǎn)物抑制的基礎(chǔ)上，基于底物濃度、滲透壓及最適pH優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌的恒pH培養(yǎng)工藝，達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1分離自新疆昌吉的一位回民的糞便樣品，發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161分離自廣東連州的一位兒童的糞便樣品，發(fā)酵乳桿菌CCFM422分離自海南省樂(lè)東黎族自治縣的酸豆角樣品，均由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、無(wú)水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Tween 80、NaCl、乳酸鈉水溶液，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母蛋白FM103、酵母浸粉FM803、酵母浸粉FM528、大豆蛋白胨FP410、牛骨蛋白胨FP326、魚(yú)骨蛋白胨FP351，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic 型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；T&J-Minipod 1L×8型迷你平行發(fā)酵罐，迪必爾生物工程有限公司；l?ser-om806 m型冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀，德國(guó)l?ser公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、乙酸鈉2、K2HPO42、檸檬酸氫二銨2、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.4。

MRS固體培養(yǎng)基：與MRS液體培養(yǎng)基配方相同，另加20 g/L的瓊脂粉。

氮源偏好分析培養(yǎng)基[10](g/L)：氮源1、葡萄糖6、K2HPO410、Na2HPO410、MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，調(diào)節(jié)pH 6.0。

MRS氮源偏好分析培養(yǎng)基(g/L)：氮源1(0.4胰蛋白胨、0.4牛肉膏、0.2酵母粉)，其他成分同氮源偏好分析培養(yǎng)基。

MRS氮源(MRS無(wú)機(jī)鹽)培養(yǎng)基(g/L)：氮源1(0.4胰蛋白胨、0.4牛肉膏、0.2酵母粉)、葡萄糖6、乙酸鈉2、K2HPO42、檸檬酸氫二銨2、MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，調(diào)節(jié)pH 6.0。上述培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌20 min。

1.3.2 菌株活化與培養(yǎng)

用接種環(huán)從保菌管中蘸取少量菌液，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，平板置于37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑取單菌落，接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。以體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量將培養(yǎng)液接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后得到活化的種子液。以下實(shí)驗(yàn)方法中的接種量均為4%。

1.3.3 菌株對(duì)不同氮源利用的偏好性分析

按照1.3.1的方法配制不同的氮源培養(yǎng)基，接入菌株后37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定OD600。

1.3.4 生長(zhǎng)限制性無(wú)機(jī)鹽分析

用NaCl代替MRS培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，保持2種培養(yǎng)基的滲透壓相同，在發(fā)酵罐中接入菌株，37 ℃恒pH 6.0培養(yǎng)至穩(wěn)定期，每2 h取樣，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，同時(shí)在穩(wěn)定期取樣，測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.5 生長(zhǎng)限制性微量元素分析

培養(yǎng)基配方(g/L)：氮源1、葡萄糖6、K2HPO410、Na2HPO410、Tween 80 1 mL。培養(yǎng)基中只添加單一的微量元素(0.05 MnSO4、0.05 MgSO4),質(zhì)量比1∶1添加MnSO4和MgSO4，空白組(兩者都不加)，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定OD600。

1.3.6 中性條件下酸根的最低抑菌濃度測(cè)定

參照崔樹(shù)茂[8]的方法，在MRS液體培養(yǎng)基中添加乳酸鈉、乙酸鈉和NaCl，配成0.1、0.2、…、1.5 mol/L的鹽溶液，在無(wú)菌環(huán)境中用NaOH或HCl將溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0。接入菌株后測(cè)定初始OD600，然后在37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600，若OD600未發(fā)生變化，說(shuō)明菌株被完全抑制，此樣品的鹽濃度為該菌株的最低抑菌濃度。

1.3.7 最適生長(zhǎng)滲透壓及完全抑制滲透壓的測(cè)定

添加3 g/L的NaCl會(huì)使培養(yǎng)基的滲透壓平均增加100 mOsm/kg，而MRS液體培養(yǎng)基的滲透壓一般在350 mOsm/kg左右，計(jì)算NaCl的添加量，配制350、400、500、…、3 300 mOsm/kg的培養(yǎng)基，接入菌株后37 ℃培養(yǎng)，每2 h取樣測(cè)定OD600，繪制菌株的耐滲透壓曲線，計(jì)算菌株的代時(shí)。

1.3.8 碳氮消耗比測(cè)定

按照1.3.1氮源偏好分析培養(yǎng)基的配方，其中的氮源為各菌株的最適氮源。在菌株發(fā)酵過(guò)程中不斷監(jiān)測(cè)OD600和發(fā)酵液中的葡萄糖濃度，計(jì)算生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比。

1.3.9 生長(zhǎng)限制性微量元素最適濃度的測(cè)定

利用恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)分析微量元素的質(zhì)量濃度及比例對(duì)活菌數(shù)的影響。培養(yǎng)基中分別稱取0.05、0.15、…、0.55 g/L的MnSO4和MgSO4，m(MnSO4)∶m(MgSO4)=1∶1，以相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件置于平行發(fā)酵罐，接入菌株后37 ℃恒pH 6.0補(bǔ)糖培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定OD600和活菌數(shù)，優(yōu)選出最佳質(zhì)量濃度。然后在最佳質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上，改變兩者的比例，重復(fù)上述操作，優(yōu)選出微量元素之間的最佳比例。

1.3.10 最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定

設(shè)置不同的pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5，接入菌株后37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定OD600及活菌數(shù)。

1.3.11 恒pH分批培養(yǎng)

根據(jù)培養(yǎng)基的底物分析，確定最優(yōu)的底物質(zhì)量濃度，根據(jù)耐滲透壓曲線和碳氮消耗比，計(jì)算培養(yǎng)基中的碳源、氮源的添加量，培養(yǎng)基的初始滲透壓應(yīng)低于菌株生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的滲透壓。在發(fā)酵罐中恒最適pH發(fā)酵，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定OD600及活菌數(shù)。

1.3.12 恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)

推算恒pH培養(yǎng)時(shí)菌體被完全抑制時(shí)消耗的最適氮源添加量，根據(jù)底物分析，配制滲透壓為350 mOsm/kg左右的培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中以最適pH進(jìn)行37 ℃恒pH補(bǔ)糖培養(yǎng)，補(bǔ)料液為400 g/L的葡萄糖溶液，穩(wěn)定期測(cè)定OD600及活菌數(shù)。具體操作如下：

配制400 g/L(c堿)的NaOH溶液和400 g/L(c糖)的葡萄糖溶液，開(kāi)啟發(fā)酵罐的補(bǔ)糖和補(bǔ)堿系統(tǒng)，關(guān)聯(lián)比例(k)根據(jù)公式(1)[8]設(shè)置：

(1)

式中：40，NaOH的摩爾分子量，g/mol；W，菌株代謝單位質(zhì)量的葡萄糖產(chǎn)生的酸摩爾數(shù)，mol/g。

1.3.13 測(cè)定方法

菌體密度的測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定發(fā)酵液的吸光度值，若吸光度值超過(guò)0.8，需要將菌液稀釋，使稀釋后菌液的吸光度值在0.2～0.8；活菌數(shù)的測(cè)定：平板菌落計(jì)數(shù)法；葡萄糖濃度的測(cè)定：葡萄糖試劑盒測(cè)定；滲透壓的測(cè)定：滲透壓儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.1繪圖，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素ANOVA判斷(鄧肯檢驗(yàn))，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 限制性底物的分析和優(yōu)化

2.1.1 氮源利用的偏好性

乳酸菌利用葡萄糖發(fā)酵的效率高，可以直接利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)代謝所需的一系列生化反應(yīng)[11]。另外葡萄糖價(jià)格低廉，綜合考慮后，選擇葡萄糖作為發(fā)酵乳桿菌的最佳碳源。

氮源作為生長(zhǎng)底物的一種，對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)起著重要的作用。由于乳酸菌中存在著不同的蛋白水解酶系，因此不同的乳酸菌利用的最適氮源不同[12]。按照1.3.3的方法，系統(tǒng)研究單位質(zhì)量(1 g)不同氮源對(duì)發(fā)酵乳桿菌的增殖效果，以此歸納出發(fā)酵乳桿菌對(duì)氮源利用的偏好性。

從表1可以看出，3株發(fā)酵乳桿菌在復(fù)合氮源(酵母浸粉528+牛骨蛋白胨+牛骨蛋白胨)培養(yǎng)基中的OD600與在其他單一氮源培養(yǎng)基中的OD600有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明發(fā)酵乳桿菌對(duì)復(fù)合氮源的利用程度較高。這與SAFARI等[13]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)復(fù)合氮源更有利于嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌等乳酸菌的生長(zhǎng)。

除此之外，比較MRS氮源組和MRS氮源(MRS無(wú)機(jī)鹽)組，可以發(fā)現(xiàn)MRS氮源(MRS無(wú)機(jī)鹽)組的OD600明顯高于MRS氮源組，說(shuō)明培養(yǎng)體系中無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵乳桿菌的增殖效果有影響，即無(wú)機(jī)鹽有可能是發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)限制性因素。

另外，朱丹鳳等[14]研究發(fā)現(xiàn)，上述氮源中的氨基酸種類和含量豐富，所以排除了由于氮源中缺少必需氨基酸而影響菌株增殖的可能。從單一氮源來(lái)看，發(fā)酵乳桿菌對(duì)微生物類氮源的利用程度較高，這是因?yàn)檫@類氮源的肽相對(duì)分子質(zhì)量90%都集中在500 Da以下(表2)，說(shuō)明發(fā)酵乳桿菌對(duì)小分子肽具有偏好性。但是將不同種類、不同分子質(zhì)量的氮源復(fù)配后，發(fā)酵乳桿菌的利用程度更高，說(shuō)明單一氮源中缺乏生長(zhǎng)因子，而復(fù)配后的氮源中富含生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)了菌株的生長(zhǎng)。綜上，酵母粉復(fù)合大分子肽的蛋白胨是發(fā)酵乳桿菌的最適氮源，這個(gè)結(jié)論可以為發(fā)酵乳桿菌工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)。

2.1.2 生長(zhǎng)限制性無(wú)機(jī)鹽

無(wú)機(jī)鹽一般是作為緩沖鹽被加入到培養(yǎng)基中，其能夠在菌體增殖時(shí)減緩發(fā)酵液pH值下降的速率，同時(shí)維持發(fā)酵環(huán)境的滲透壓。姚國(guó)強(qiáng)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LactobacillusreuteriIMAU10240在缺乏無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)速率明顯受到抑制。但是大部分乳酸菌在恒pH條件下生長(zhǎng)時(shí)，其增殖情況并不受無(wú)機(jī)鹽存在與否的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比發(fā)酵乳桿菌在2種培養(yǎng)基(添加無(wú)機(jī)鹽、未添加無(wú)機(jī)鹽)中的生長(zhǎng)情況，探究在恒pH培養(yǎng)時(shí)，無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)是否有促進(jìn)作用。

表2 不同氮源的肽分布 單位：%

由2.1.1的結(jié)果可知，分批培養(yǎng)時(shí)，添加的無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)發(fā)酵乳桿菌的增殖有一定的影響。但是，由圖1可知，在恒pH培養(yǎng)時(shí)，3株發(fā)酵乳桿菌在2種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況大致相同，且穩(wěn)定期的活菌數(shù)也不存在顯著性差異(P>0.05)。由此可以得知，在恒pH培養(yǎng)時(shí)，緩沖鹽的作用是維持發(fā)酵液pH的相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)機(jī)鹽的添加并不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳桿菌的增殖起到促進(jìn)作用。

a-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1;b-發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161;c-發(fā)酵乳桿菌CCFM422圖1 發(fā)酵乳桿菌未添加和添加無(wú)機(jī)鹽恒pH培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線及活菌數(shù)Fig.1 Growth curve and viable counts of L.fermentum cultured at constant pH with inorganic salts and or no inorganic salts注：不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05),相同代表差異不顯著(下同)

2.1.3 生長(zhǎng)限制性微量元素分析

微量元素是一類對(duì)微生物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但需要量極少的元素，通常是作為某些活性物質(zhì)的組成成分或者酶的激活劑發(fā)揮作用[16]。在異型乳酸發(fā)酵中，Mn2+、Mg2+是多個(gè)關(guān)鍵酶的輔酶因子。Mg2+參與核蛋白體的聚合[17]，適量的Mg2+能促進(jìn)ATP的合成[18]。另外，李興峰[19]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Mg2+對(duì)乳酸脫氫酶的酶活有促進(jìn)作用。CHENG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+在植物乳桿菌中充當(dāng)了“代謝轉(zhuǎn)換”的作用，它調(diào)節(jié)了丙酮酸到乳酸等代謝途徑的代謝通量。因此，一般在發(fā)酵培養(yǎng)基中都會(huì)添加MnSO4和MgSO4來(lái)促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)。

由圖2可知，Mn2+和Mg2+對(duì)3株發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，發(fā)酵乳桿菌在Mn2+和Mg2+均添加的情況下生長(zhǎng)效果明顯優(yōu)于只添加單一微量元素的組別和空白組，具有顯著性差異(P<0.05)。因此，可以判定Mn2+和Mg2+是發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)限制性微量元素。

a-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1;b-發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161;c-發(fā)酵乳桿菌CCFM422圖2 發(fā)酵乳桿菌限制性微量元素分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of limiting trace elements of L.fermentum

2.2 代謝產(chǎn)物的抑制

2.2.1 酸根積累對(duì)菌株的抑制作用

按照1.3.6的方法，研究pH 7.0條件下未解離的酸根對(duì)發(fā)酵乳桿菌的抑制，判斷酸根是否是發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)的主要限制性因素。測(cè)定了pH 7.0條件下NaCl、乙酸鈉和乳酸鈉對(duì)發(fā)酵乳桿菌的最低抑菌濃度。NaCl對(duì)菌株的抑制主要是滲透壓抑制，因此將NaCl的最低抑菌濃度作為研究酸根抑制的對(duì)照。若乙酸鈉和乳酸鈉的最低抑菌濃度低于NaCl的最低抑菌濃度，則表明酸根對(duì)發(fā)酵乳桿菌具有特異性毒害作用。

由表3可知，NaCl、乙酸鈉和乳酸鈉在pH 7.0條件下對(duì)發(fā)酵乳桿菌的最低抑菌濃度均相同，說(shuō)明pH 7.0時(shí)，乙酸根和乳酸根對(duì)這3株發(fā)酵乳桿菌的抑制是由于酸根積累引起的滲透壓升高，即，未解離的酸根并不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳桿菌有特異性毒害作用，發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)主要是受到滲透壓的抑制。

表3 NaCl、乙酸鈉和乳酸鈉在pH 7.0時(shí)對(duì)發(fā)酵乳桿菌的最低抑菌濃度 單位：mmol/L

2.2.2 最適生長(zhǎng)滲透壓與完全抑制滲透壓

由2.2.1的結(jié)果可知，發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)的主要抑制因素是酸根積累引起的滲透壓升高，因此，需要重點(diǎn)研究每株菌對(duì)環(huán)境滲透壓的耐受程度，以此更好地優(yōu)化菌株的培養(yǎng)工藝。

由圖3可知，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1和FGDLZR161在滲透壓為1 000 mOsm/kg時(shí)生長(zhǎng)速率被抑制，發(fā)酵乳桿菌CCFM422在滲透壓為1 200 mOsm/kg時(shí)生長(zhǎng)速率被抑制。

2.3 培養(yǎng)工藝的優(yōu)化

2.3.1 底物濃度的優(yōu)化

2.3.1.1 碳氮比

基于2.1.1最適氮源的結(jié)果，按照1.3.8的方法，測(cè)定發(fā)酵乳桿菌利用最佳氮源生長(zhǎng)速率被抑制和完全被抑制時(shí)的葡萄糖濃度，結(jié)果如表4所示。

表4 發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)速率被抑制和完全被抑制時(shí)的碳氮消耗比Table 4 Ratio of carbon and nitrogen consumption when the growth rate of L.fermentum was suppressed and completely suppressed

DISHISHA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中碳源和氮源比例過(guò)低時(shí)，菌體代謝旺盛產(chǎn)生大量的代謝廢物，從而抑制菌體增殖；碳源和氮源比例過(guò)高時(shí)，菌體主要利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)合成積累代謝產(chǎn)物。王玉林等[22]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的最適碳氮比為生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的消耗比時(shí)，菌株的增殖效率最高。由表4可知，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1和CCFM422的最佳碳氮比為2.7，發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161的最佳碳氮比為2.8。基于菌株生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮比結(jié)果及滲透壓值，最大程度地提高培養(yǎng)基中的碳、氮含量，以此提高菌株的發(fā)酵密度。

2.3.1.2 限制性微量元素濃度及比例的優(yōu)化

由2.1.3的結(jié)果可知，Mn2+和Mg2+均是發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)限制性微量元素，因此，探究Mn2+、Mg2+質(zhì)量濃度及比例與活菌數(shù)之間的關(guān)系。

a、c、e-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422的耐滲透壓曲線;b、d、f-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422不同滲透壓下的代時(shí)圖3 發(fā)酵乳桿菌的耐滲透壓曲線及不同滲透壓下的代時(shí)Fig.3 The osmotic pressure curve of L.fermentum and the generation time under different osmotic pressure conditions

由圖4-a、4-c、4-e可知，確定m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1時(shí)，Mg2+和Mn2+的總質(zhì)量濃度越高，活菌數(shù)越高，但增加到一定程度后，活菌數(shù)的變化差異不大，說(shuō)明一定范圍內(nèi)提高M(jìn)g2+和Mn2+的質(zhì)量濃度，可以提高菌體的增殖效果。這與PHAM等[23]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)Mn2+質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制α-葡萄糖苷酶等水解酶，對(duì)菌體增殖造成負(fù)面影響。

在Mg2+、Mn2+的最適質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上改變Mg2+和Mn2+的比例，由圖4-b、4-f可知，m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1時(shí)，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1和CCFM422的活菌數(shù)與其他組有顯著性差異(P<0.05)；而圖4-d表明Mg2+和Mn2+的質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161的影響不是很大。

綜上，培養(yǎng)發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1的微量元素為m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1，總質(zhì)量濃度為0.35 g/L；培養(yǎng)發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161的微量元素為m(Mg2+)∶m(Mn2+)=3∶1，總質(zhì)量濃度為0.35 g/L；培養(yǎng)發(fā)酵乳桿菌CCFM422的微量元素為m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1，總質(zhì)量濃度為0.45 g/L。

2.3.2 最適生長(zhǎng)pH

乳酸菌的最適生長(zhǎng)pH值一般在5.0～7.0，不同乳酸菌的最適生長(zhǎng)pH不同。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，從而使發(fā)酵液pH低于正常生長(zhǎng)pH范圍，導(dǎo)致菌株的細(xì)胞膜滲透性和細(xì)胞內(nèi)酶活性受到干擾[24]。在確定了最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的pH梯度，探究3株發(fā)酵乳桿菌的最適生長(zhǎng)pH。

從圖5可以看出，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1的最適pH值為6.0，發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161和CCFM422的最適pH值為5.5。

a、b-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1 Mg2+、Mn2+的濃度和比例優(yōu)化結(jié)果;c、d-發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161 Mg2+、Mn2+的濃度和比例優(yōu)化結(jié)果;e、f-發(fā)酵乳桿菌CCFM422 Mg2+、Mn2+的濃度和比例優(yōu)化結(jié)果圖4 發(fā)酵乳桿菌限制性微量元素質(zhì)量濃度及比例優(yōu)化Fig.4 Optimization results of the mass concentration and proportion of limiting trace elements in L.fermentum

圖5 發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)pH優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of growth pH of L.fermentum

2.3.3 恒pH分批培養(yǎng)

恒pH分批培養(yǎng)，是將底物一次性加到發(fā)酵罐中恒pH培養(yǎng)。根據(jù)上述的限制性底物分析結(jié)果以及耐滲透壓曲線和碳氮消耗比，確定培養(yǎng)基中的碳源、氮源、微量元素的添加量，需要注意的是培養(yǎng)基的初始滲透壓應(yīng)低于菌株生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的滲透壓。

(1)發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1恒pH分批培養(yǎng)

由表5可知，培養(yǎng)基初始滲透壓接近于生長(zhǎng)速率被抑制的滲透壓時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最大。因此，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1恒pH分批培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉528 8、牛骨蛋白胨 16、魚(yú)骨蛋白胨 16)，葡萄糖 108，MgSO40.175，MnSO40.175，Tween 80 1 mL，恒pH 6.0培養(yǎng)，活菌數(shù)為(1.3±0.1)×1010CFU/mL，較在MRS靜置培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)(3.2±0.07)×109CFU/mL，提高了3.1倍。

(2)發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161恒pH分批培養(yǎng)

由表6可知，培養(yǎng)基初始滲透壓接近于生長(zhǎng)速率被抑制的滲透壓時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最大。因此，發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161恒pH分批培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉528 8、牛骨蛋白胨 16、魚(yú)骨蛋白胨 16)，葡萄糖 112，MgSO40.26，MnSO40.09，Tween 80 1 mL，恒pH 5.5培養(yǎng)，活菌數(shù)為(1.1±0.1)×1010CFU/mL，較在MRS靜置培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)(2.3±0.03)×109CFU/mL，提高了3.8倍。

表5 發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1的恒pH分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)結(jié)果Table 5 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FXJCJ6-1

表6 發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161的恒pH分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)結(jié)果Table 6 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FGDLZR161

(3)發(fā)酵乳桿菌CCFM422恒pH分批培養(yǎng)

由表7可知，氮源40和45 g/L條件下活菌數(shù)差異不大，考慮成本問(wèn)題，選擇40 g/L的氮源進(jìn)行培養(yǎng)。因此，確定發(fā)酵乳桿菌CCFM422恒pH分批培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉 528 8、牛骨蛋白胨 16、魚(yú)骨蛋白胨 16)，葡萄糖 108，MgSO40.225，MnSO40.225，Tween 80 1 mL，恒pH 5.5培養(yǎng)，活菌數(shù)為(9.5±0.5)×109CFU/mL，較在MRS靜置培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)(1.7±0.07)×109CFU/mL，提高了4.6倍。

表7 發(fā)酵乳桿菌CCFM422的恒pH分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)結(jié)果Table 7 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum CCFM422

2.3.4 恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)

恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)是基于較低的滲透壓條件，后期根據(jù)底物消耗自動(dòng)補(bǔ)料，這種培養(yǎng)模式避免了高濃度底物引起的限制，可以最大程度地減緩發(fā)酵液滲透壓的升高，對(duì)耐滲透壓能力較弱菌株的增殖效果較好。結(jié)果如圖6所示。

a-發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1;b-發(fā)酵乳桿菌FGDLZR161;c-發(fā)酵乳桿菌CCFM422圖6 發(fā)酵乳桿菌恒pH分批培養(yǎng)和自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)結(jié)果Fig.6 Constant pH automatic feedback sugar supplement results of L.fermentum

恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422穩(wěn)定期活菌數(shù)分別為(6.8±0.1)×109、(7.9±0.9)×109和(7.1±0.2)×109CFU/mL。由于發(fā)酵乳桿菌能夠耐受較高的滲透壓，所以恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)的低滲優(yōu)勢(shì)沒(méi)有得到很好的體現(xiàn)。因此選擇恒pH分批培養(yǎng)來(lái)增殖發(fā)酵乳桿菌。

3 結(jié)論

(1)發(fā)酵乳桿菌對(duì)不同種類的氮源利用偏好性不同，酵母粉復(fù)合大分子肽的蛋白胨是發(fā)酵乳桿菌的最適氮源。

(2)無(wú)機(jī)鹽只是起到減緩發(fā)酵液pH降低速率的作用，在恒pH培養(yǎng)發(fā)酵乳桿菌時(shí)，添加無(wú)機(jī)鹽并不能提高菌株的增殖效果。

(3)Mn2+和Mg2+均是發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)限制性微量元素，菌體的高效增殖需要兩者同時(shí)存在。

(4)中性條件下，酸根積累并不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳桿菌有特異性毒害作用，發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)主要是受到滲透壓的抑制，且發(fā)酵乳桿菌能夠耐受較高的滲透壓環(huán)境。

(5)恒pH分批培養(yǎng)是發(fā)酵乳桿菌的最優(yōu)培養(yǎng)工藝。恒pH分批培養(yǎng)發(fā)酵乳桿菌時(shí)，初始底物濃度應(yīng)基于菌株的耐滲透壓曲線進(jìn)行設(shè)定，培養(yǎng)基的初始滲透壓應(yīng)接近于菌株生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的滲透壓，而培養(yǎng)基中的碳氮源添加比例應(yīng)按照菌株生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比進(jìn)行設(shè)定。