全營養流加對谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸的影響

熊海波，陳志超，曹華杰，徐慶陽,3,4*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(河南巨龍生物工程股份有限公司，河南 平頂山，467500) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)4(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457)

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，作為重要的食品添加劑，可調節食品中的氨基酸平衡[1]，強化食品的營養價值，同時在肝臟中不能被降解，可直接進入血液，將直接影響肝臟中血糖的水平，被用于配制特殊的治療型輸液及藥物，因而被廣泛應用于食品和醫藥等行業，具有巨大的商業價值[2]。

L-異亮氨酸菌種改造及發酵優化的方法很多，菌體誘變有通過常溫常壓等離子體誘變[3]、采用紫外、亞硝基胍等復合誘變手段[4-5]；菌種改造有過表達雙組份轉運系統BrnFE操縱子[6]、利用基因重組技術替換ilv LXGMEDA啟動子并過表達解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilv A和ilv IH等方法[7-8]；發酵優化有對培養基成分葡萄糖、玉米漿、硫酸銨等的優化[9-10]，也有對pH[11]、溶氧等在線條件優化[12-13]，這些方法對L-異亮氨酸產量的提高都有很大幫助。

對于谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸的最大難題在于副產物積累過多，導致抑制菌體細胞生長，降低菌體活力、產酸下降。本實驗通過全營養流加工藝[14]，探究底物培養基與流加料最適濃度，使菌體始終處于最適發酵環境[16]。實驗分為低濃度全營養流加，低初始營養偶聯發酵全營養流加，絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加3個階段，找出L-異亮氨酸產量最高、副產物纈氨酸(valine，Val)，亮氨酸(leucine，Leu)，丙氨酸(alanine，Ala)最低的流加條件；同時利用氮源替換實驗，探究出玉米漿與絲肽粉對發酵的影響[17]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)YILM1504 (LysL+MetL+AHVr+SGr+Ile-Hxr)，由天津科技大學代謝工程實驗室保存。

1.2 發酵培養基

發酵培養基(1)：葡萄糖70 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO42.2 g/L，VB10.2 mg/L，豆餅水解液20 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，玉米漿干粉50 g/L。

發酵培養基(2)：葡萄糖70 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO42.2 g/L，VB10.2 mg/L，豆餅水解液20 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，絲肽粉 50 g/L。

1.3 儀器與設備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L 自動控制發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies；KQ-C 高壓蒸汽發生器，上海奉賢協新機電廠；752 分光光度計，上海分析儀器廠；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本 OLYMPUS 會社。

1.4 培養方法

斜面培養條件：一代試管斜面活化2根，恒溫箱32 ℃培養24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒溫箱32 ℃培養18 h。

種子罐培養條件：接種量2支茄形瓶，發酵體積2 L，培養溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，通風2.0 L/min，罐壓0.05 MPa，初始轉速200 r/min，轉速上限930 r/min，轉速與溶氧聯動，種子培養12～15 h。

發酵罐培養條件：接種量600 mL，發酵體積3 L, 培養溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉速由200 r/min逐步提加到930 r/min；通風由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min，轉速與溶氧聯動，發酵時間36～40 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 高濃度底料、低濃度全營養流加方法

A(B、C、D)流加策略為發酵罐配制100%(1)號培養基2.7 L，從20 h流加300 mL 0%(5%、10%、15%)(1)號培養基濃縮液，濃縮液40 h流加完。

1.5.2 低初始營養偶聯發酵全營養流加策略

E(F、G、H)流加策略為發酵罐配制10%(30%、50%、70%)(1)號培養基2.7 L，從0 h流加300 mL 90%(70%、50%、30%)(1)號培養基濃縮液，濃縮液全程流加，底料與流加料質量固定為3 L(1)號培養基。

1.5.3 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加方法

將(1)號培養基中玉米漿等質量置換為絲肽粉成為(2)號培養基。

I、J、K流加策略以F流加策略為基準，分別將其中的(1)號培養基等比例置換成30%、70%、100%(2)號培養基。全營養流加策略如表1所示。

1.6 檢測方法

1.6.1 pH值測定

發酵罐自帶的梅特勒pH在線檢測，用pH試劑進行放液驗證檢測。

1.6.2 菌體生物量測定

菌體生物量以每升發酵液中菌體干重(g DCW/L)表示。發酵液離心后用去離子水洗滌菌體2次，于80 ℃恒溫箱中加熱至恒重后，用分析天平稱重。

表1 全營養流加策略Table 1 Total nutrient flow plus strategy

1.6.3L-異亮氨酸及副產物測定

發酵液中L-異亮氨酸和副產物濃度用高效液相色譜法測定。采用AgilentC18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱，衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.7 計算方法

糖酸轉化率(sugar acid,SA)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ，L-異亮氨酸質量濃度，g/L；V，發酵液總體積，L；m，總耗糖量，g。

所有實驗數據取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnet t檢驗來確定數據差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 低濃度全營養流加對發酵的影響

在氨基酸生產過程中，常采用一次性投料發酵，但初始發酵時發酵液中高濃度營養會造成菌體的營養中毒，抑制菌體的生長，同時導致菌體代謝途徑的異常，使得發酵罐內某些營養物質消耗過快，極容易發生菌體過早衰亡的現象。首先，本實驗為延長生長周期，提升菌體活力，通過發酵初期低營養，發酵過程全營養流加工藝，探究發酵中后期全營養流加對發酵的影響，實驗設置A、B、C、D 4種流加策略，以策略A為對照組，進行發酵對比實驗。

圖1 低濃度全營養流加對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.1 Effect of low concentration total nutrient flow on biomass and L-isoleucine注：實心圖標為菌體生物量、空心圖標為L-異亮氨酸產量(圖4、圖7同)

由圖1可知，流加策略A為全營養培養基底料，不流加培養基，發現發酵至15 h后，菌體活力降低，20 h菌體生物量開始下降，從最高菌體量30.6 g/L降低到23.3 g/L，同時此時產酸能力放緩，L-異亮氨酸產量為29.7 g/L。為解決發酵中后期菌體生物量下降問題，流加策略B、C、D分別在20 h流加5%、10%、15%的全營養培養基濃縮液，發現菌體量停止下降且小幅上升，最終菌體量分別達到了33.3、37.2、34.8 g/L，比對照組最終菌體量提高了42.9%、59.7%、49.4%，L-異亮氨酸分別達到了29.0、33.0、31.5 g/L，比對照組提高了26.1%、43.5%、40.0%。

由圖2可知，隨著流加糖濃度的上升，發酵葡萄糖消耗量逐漸上升但幅度較小，分別比對照組多消耗了3.3%、4.7%、5.6%；但葡萄糖對菌體轉化率及L-異亮氨酸轉化率顯著上升(P<0.05),在26 h，對照組葡萄糖對菌體轉化率<0.01 g/g，菌體活力極弱，菌體生長繁殖近乎停滯；隨著對發酵罐流加全營養培養基濃縮液，20 h后葡萄糖對菌體轉化率明顯上升，26 h轉化率達到了0.08、0.1、0.1，菌體仍有活力；同時26 h B、C、D流加策略的葡萄糖對L-異亮氨酸的轉化率都為0.22 g/g，流加策略效果顯著。

圖2 低濃度全營養流加對葡萄糖消耗及轉化率的影響Fig.2 Effects of low concentration total nutrient flow on glucose consumption and glucose conversion注：實心圖標為葡萄糖消耗量、空心圖標為葡萄糖對菌體轉化率、半實心半空心為葡萄糖L-異亮氨酸轉化率(圖5同)

由圖3可知，流加策略對合成L-異亮氨酸提升效果明顯，同時對副產物的降低也有作用，流加策略B、C、D的Val分別達到了5.0、6.8、6.1 g/L，比對照組降低了37.5%、15.2%、23.8%，Leu分別為3.2、3.8、3.4 g/L，比對照組降低了46.7%、36.7%、43.3%，Ala分別為2.8、3.2、3.1 g/L，比對照組降低了37.8%、28.9%、31.1%。

圖3 低濃度全營養流加對產酸的影響Fig.3 Effects of low concentration total nutrient flow on acid production

由上述結果可知，通過發酵中后期全營養流加策略，提高了葡萄糖的利用率及產酸能力，解決了20 h后菌體迅速衰亡、活力弱的缺點，這是因為流加培養基修正了發酵中后期某些必需元素缺失的問題，使菌體能夠再次正常生長，延長了菌體發酵周期，但副產物Val、Leu、Ala相對于后續分離提取還是過多。3種副產物的積累過多使菌體代謝異常，再次影響了菌體的正常生長，同時出現糖酸轉化率低、產品質量下降、提取困難等一系列問題。

2.2 低初始營養偶聯發酵全營養流加策略

為了解決發酵初期底物營養過豐富而抑制菌體的問題，本實驗通過降低初始發酵培養基的營養成分，采用低濃度初始發酵培養基發酵，在發酵過程流加全營養，以期降低發酵初期高營養抑制，并通過流加解決后期營養不足的問題。設計E、F、G、H流加策略，以A的培養基含量為基準，將培養基按比例分為底料與流加料，發酵全程流加，探究最適底料與流加料分配比例。

由圖4可知，生物量與L-異亮氨酸隨著底料與流加料質量比上升而上升，當底料與流加料為3∶7時，產酸與生物量達到最高。發酵40 h，流加策略E、F、G、H的菌體量分別為43.0、46.0、42.0、40.0 g/L，比對照組最大菌體量提高了40.5%、50.3%、37.3%、30.7%，L-異亮氨酸產量達到了34.8、36.8、34.0、33.6 g/L，比對照組分別提高了17.2%、23.9%、14.5%、13.1%。菌體量與L-異亮氨酸隨著底料與流加料比例增加增長明顯，因此高濃度底料是限制菌體增長的重要因素之一[18]。

圖4 低初始營養偶聯全營養流加策略對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.4 Effects of total nutrient flow addition strategy on biomass and L-isoleucine in low initial nutrient

菌體對葡萄糖的利用率是評價菌株優良性狀及發酵能力的重要指標之一，同時也是產品工業化生產的重要指標之一[19]。由圖5可知，葡萄糖對菌體及L-異亮氨酸的轉化率隨著底料與流加料比例的增加而增長，其表現為流加策略E、F、G、H的葡萄糖對L-異亮氨酸的轉化率后期下降平穩，26 h轉化率分別為0.29、0.30、0.28、0.23 g/g,比對照組提高了93.3%、100%、86.7%、53.3%，且始終保持在0.1 g/g以上；E、F、G、H的葡萄糖對菌體的轉化率分別為0.10、0.13、0.10、0.11 g/g，菌體活力旺盛。根據葡萄糖消耗曲線，E、F、G、H的葡萄糖消耗量分別為349.7、361.2、382.0、383.5 g/g，比對照組提升了3.0%、6.4%、12.5%、13.0%；可以看出葡萄糖消耗的增加量遠小于葡萄糖對菌體及L-異亮氨酸的轉化能力的提升，說明不同比例低濃度培養基底料添加與全營養流加有利于糖的正向利用率，減少了菌體細胞內其他非需求物質的產生，代謝主流導向理想載流途徑[20]。

圖5 低初始營養偶聯發酵全營養流加策略對葡萄糖消耗量及轉化率的影響Fig.5 Effects of total nutrient flow plus strategy on glucose consumption and glucose conversion in low initial nutrient

圖6-a中，E、F、G、H的Val分別為5.2、5.6、6.2、6.0 g/L，比對照組降低了35.0%、30.0%、22.5%、25.0%；圖6-b中，E、F、G、H的Leu分別為2.2、2.3、2.7、3.0 g，比對照組降低了21.4%、17.9%、3.6%、7.1%；圖6-c中，E、F、G、H的Ala分別為1.7、2.1、2.3、2.1 g/L，比對照組降低了39.3%、25%、17.9%、25%。從副產物曲線趨勢可以看出，Val、Leu與Ile出現時間相近、產酸協同，且增長趨勢都隨著時間的推移逐漸降低；Ala的直接前體是丙酮酸，而Val、Leu的直接前體也是丙酮酸，隨著發酵時間的持續，Val、Leu逐漸降低，而Ala卻隨著時間的推移越來越多。

從以上結果分析可知，底料、流加料雙梯度全營養流加對生物量及L-異亮氨酸的生成效果顯著，且降低了副產物的生成，解決了高濃度培養基對菌體生長及產酸的抑制作用[21]；但生成的副產物對于產品純化及產品工業化來說，同樣相對較高，所以需要找到一種方法，在保持對L-異亮氨酸產量影響較小的情況下，將副產物降低到產業化標準的濃度之下。

2.3 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加對L-異亮氨酸的影響

同時，在發酵過程中發現，由于玉米漿使用量過大，造成滅菌困難，容易染菌；玉米漿中蛋白質含量高，造成發酵過程泡沫過多，溶氧不足；玉米漿中灰分高，造成分離提取產物雜質高等問題。因此，有必要降低玉米漿的用量，利用清潔的有機氮源替換玉米漿。本實驗利用絲肽粉代替一部分玉米漿。設計氮源替換實驗，以流加策略F為基準，將發酵培養基(1)中玉米漿逐步替換為絲肽粉，探究玉米漿與絲肽粉在發酵中對副產物生成的影響。

由圖7可知，隨著絲肽粉替換玉米漿比例的上升，菌體生物量及產酸能力逐漸降低，發酵40 h，流加策略I、G、K的生物量為44.2、41.4、40.0 g/L，比對照組提升了89.7%、77.7%、71.7%，卻比基準組F降低了3.9%、10.0%、13.0%；L-異亮氨酸產量為 36.1、34.2、33.1 g/L，比對照組提高了21.5%、15.2%、11.4%，比基準組降低了1.9%、7.1%、10.1%。玉米漿中含有大量的亞硫酸、肽、多糖、蛋白質和各種氨基酸，在氨基酸發酵中被用作有機氮源和生長因子的供應者，從結果可以看出在提高產酸能力、促進菌體生長的功能上玉米漿無法被絲肽粉替代。

圖7 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.7 Effects of total nutrient flow on biomass and L-isoleucine in corn pulp with equal proportion of silk peptide powder

丙酮酸是Val、Leu的直接前體，同時反應生產活性乙醛與乙酰輔酶A，活性乙醛參與合成Ile和Val，乙酰輔酶A參與Leu的合成，前體物對Val、Leu的生成有協同作用；乙酰羥基酸合成酶、二羥基脫水酶、支鏈氨基酸轉氨酶等一系列酶共同參與三支鏈氨基酸的合成，反應酶對Ile和Val、Leu的生成有協同作用。由圖8可知，在L-異亮氨酸產量降低的同時，副產物Ile和Val、Leu也大幅降低，這驗證了Ile、Val、Leu生產協同的結論。流加策略I、G、K的Val分別為1.4、1.2、1.0 g/L，比對照組降低了82.5%、85%、87.5%；Leu分別為0.8、0.6、0.5 g/L，比對照組降低了75.0%、81.3%、84.4%；Ala分別為0.5、0.3、0.3 g/L，比對照組降低了78.6%、82.1%、82.1%。絲肽粉為優質清潔氮源，其生物素含量低、灰分≤6%，總氮(以N計)≥30%，同時從葡萄糖對L-異亮氨酸的轉化率曲線可以看出，隨著絲肽粉替換玉米漿比例的增加，轉化率逐漸上升。

由上述結果可以得出，絲肽粉在抑制菌體的生成及L-異亮氨酸的產量上不及玉米漿，但會大幅度降低副產物Val、Leu、Ala的生成，達到工業生產及產品純化的要求，所以為了既減少對菌體和L-異亮氨酸的抑制，又減少副產物的生成，可以選用流加方法I，即在F的流加基礎上，將30%的玉米漿替換為絲肽粉，對產酸能力影響較小，L-異亮氨酸產量達到36.1 g/L，同時副產物Val、Leu、Ala分別為1.4、0.8、0.5 g/L，達到產業化標準。

圖8 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加對產酸及轉化率的影響Fig.8 Effects of total nutrient flow on acid production and conversion of corn pulp with equal proportion of silk peptide powder to replace the corn syrup

3 結論

在谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸過程中，L-異亮氨酸產量及副產物含量是評價菌株優良性狀及發酵能力的重要指標之一。實驗通過高濃度底料、低濃度全營養流加策略，提升中后期菌體活力，加強產酸能力，其底料為3 L發酵培養基，在20 h后流加10%(1)號全營養培養基，最終生物量與L-異亮氨酸分別達到了37.2、33.0 g/L，比對照組提高了57.7%、43.5%。為解決前期高營養對菌體造成營養中毒，實驗通過降低初始發酵培養基的營養成分，采用低濃度初始發酵培養基發酵，在發酵過程流加全營養，發現配制3 L發酵培養基，底料一次性添加30%，剩下70%作為濃縮液全程流加，使得生物量與L-異亮氨酸達到了46.0、36.8 g/L，比對照組提高了97.4%、60.0%。為減少由于玉米漿的高用量造成發酵染菌、起泡過多及后提取困難等問題,同時降低發酵副產物，提高產品純度，實驗設計氮源替換實驗，用清潔絲肽粉等比例替換玉米漿全營養流加，最終發現流加策略I最優，即將發酵培養基中30%的玉米漿替換為絲肽粉，使得副產物Val、Leu、Ala分別為1.4、0.8、0.5 g/L，比對照組降低了82.5%、86.7%和88.9%，同時探究出玉米漿有利于菌體的生長及L-異亮氨酸產量的提高，而絲肽粉有利于發酵中副產物Val、Leu、Ala的降低。