不同產區葡萄酒多酚物質抗氧化活性差異及相關性分析

趙昊，宋晶晶，于佳俊，張曉蒙，張鳳杰，李濤，武運*，薛潔,3*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 3(中國葡萄酒產業技術研究院，寧夏 銀川，750021)

葡萄酒是以葡萄為原料，經過發酵后產生乙醇的一種天然酒精類飲品[1]。葡萄酒對飲用者健康功能的影響一直備受關注，科研人員不斷深入研究其原理與功效。葡萄酒中酚類物質大多來自葡萄原料，根據化學結構可分為類黃酮與非類黃酮類。酚類物質的組成、含量，密切影響著葡萄酒色澤、收斂性、苦味等酒體結構因素[2]。目前，葡萄酒抗氧化和預防疾病等功效，均是建立在酚類物質的高生理活性上得以實現的[3]。

葡萄酒在國際市場中流行度僅次于啤酒，而葡萄酒進入中國市場時間較短，具有很大的市場潛力。據統計，我國葡萄酒消費量為每人0.40 L，而世界人均消費量大于6 L，可見我國葡萄酒消費總體水平偏低[4]。2020年1～6月全國進口葡萄酒達0.9億萬L，全國葡萄酒產量達12.71萬L。中國現已成為全球第六大葡萄酒生產國，第八大進口國[5-6]，我國市場的潛力之大，備受國際關注。

隨著生活水平的提高及葡萄酒產業的快速成長，我國葡萄酒消費群體已逐漸形成，綠色健康的概念備受關注。大多消費者尚未全面了解葡萄酒，他們的購買欲望來自于健康價值與功效，但只依據商家品牌宣傳及價格差異，并不可靠。我國葡萄酒產業歷史相對較短，標準與體制仍需完善。運用試驗方法對葡萄酒樣品的功能性成分及抗氧化值進行測定，為消費者提供數據支持[7-8]。

葡萄酒的有益物質主要是生物活性成分(多酚類化合物)。本研究將采自于西北部產區(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)及中部產區(河北產區)葡萄酒為樣本，測定其多酚組成及抗氧化能力，分析樣品間差異性及相關性，探究影響抗氧化功效的單體酚物質，為葡萄種植及釀造提出參考建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅、白葡萄酒，產于西北部產區(焉耆盆地、吐哈盆地、伊犁河谷、天山北麓)及中部產區(河北產區)，詳情見表1。

槲皮素、柚皮素、香豆素、橙皮苷、楊梅素、蘆丁、山奈酚、沒食子酸、丁香酸、水楊酸、香草酸、原兒茶酸、咖啡酸、對香豆酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、反式白藜蘆醇，Sigma公司。

福林酚、DPPH、水溶性VE(trolox)、7-二甲氨基香豆素-4-乙酸(7-dimethylaminocoumarin-4-aceticacid,DMACA)、ABTS+，美國Spectrum公司。

表1 葡萄酒樣品Table 1 Wine sample

1.2 儀器與設備

Essentia LC-15C高效液相色譜(含LC-10Atvp多元泵、SPD-10Avp檢測器、CTO-10Avp柱溫箱、SCL-10Avp系統控制)、島津UV—2450分光光度計，島津制作所；RN-36旋轉蒸發器，上海安亭生化儀器廠；萬分之一天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司;SHD-Ⅲ循環水式多用真空泵，鞏義予華儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 常規理化指標測定

測定葡萄酒中總糖(以葡萄糖計)、總酸(以酒石酸計)、pH的方法主要參照GB/T 15038—2006[9]，所有酒樣均重復測定3次。

1.3.2 多酚類物質理化指標測定

總酚、總花色苷、總黃酮和總黃烷-3-醇分別采用Folin-Ciocalteu法[10]測定(以干沒食子酸當量表示)、pH示差法測定(以矢車菊素-3-葡萄糖苷當量表示)[11]、三氯化鋁法測定(以兒茶素當量表示)[7]及DMACA法[7]測定(以兒茶素當量表示)。

1.3.3 單體酚測定

1.3.3.1 樣品前處理

取50 mL酒樣，在萃取瓶中加入50 mL無水乙醚進行萃取，將酯相取出，再加入同體積無水乙醚重復萃取2次，合并3次酯相。溫度條件為35 ℃，減壓濃縮至干，加入10 mL甲醇溶解，過0.45 μm濾膜，-30 ℃保存待測。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：C18(4.6×250 mm，3.5 m)；流動相：A相(5%甲醇+0.1%甲酸+水)，B相(5%乙腈+0.1%甲酸+甲醇)；流速1.0 mL/min；進樣量10 uL；柱溫35.0 ℃；檢測器采集280 nm波長下的信號。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.3.3 標準溶液配制

稱取20.0 mg蘆丁、香豆素等21種標準品，各標準品分別在10 mL棕色容量瓶中用甲醇定容，-30 ℃保存備用。準備實驗時，將標準儲備液用甲醇溶液稀釋儲備液配制標準和混合標準液。

1.3.4 反式白藜蘆醇測定

測定參考薛潔的方法[12]。

1.3.5 體外抗氧化能力評價

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

將0.1 mL樣品加到3.9 mL DPPH甲醇溶液中，避光反應20 min，在517 nm處測吸光值，結果用Trolox當量值(μmol/L)表示，均重復處理測定3次。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

取0.1 mL葡萄酒樣品加到3.9 mL ABTS+溶液(吸光值在734 nm處為0.70±0.02)中，避光反應時長為8 min，在734 nm處測定吸光值，結果用Trolox當量值(μmol/L)表示。

1.3.5.3 羥自由基清除能力測定

在試管中加入1 mL樣品、1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸/乙醇溶液，并做空白對照組。不同組均先加入1 mL H2O2反應，37 ℃條件下水浴30 min，樣品液本底用1 mL蒸餾水代替，在510 nm處測定吸光度(用蒸餾水做參比),計算如公式(1)所示。

式中:A0、Ax、Ax0分別為空白組、樣品組和樣品溶液本底組的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 樣品理化指標對比

由表3可知，不同樣品葡萄酒的總糖、總酸、pH值、酒精度指標均符合GB/T 15037—2006。

表3 不同葡萄酒的常規理化指標Table 3 Routine physical and chemical indexes of different red wine

其中，不同酒樣中，紅葡萄酒總糖值為1.79～3.82 g/L，白葡萄酒總糖值為1.56～3.54 g/L；紅葡萄酒總酸值為4.52～5.11 g/L，白葡萄酒總酸值為5.64～7.11 g/L；紅葡萄酒pH值為3.61～4.01，白葡萄酒pH值為3.41～3.80。各樣品基本理化指標存在一定差異，這可能與原料品種及成熟情況有較大關系。紅葡萄酒樣品的酒精度高于白葡萄酒樣品，這是因為氮元素在葡萄酒浸漬的過程種被很大程度促進釋放，其可影響酵母活性，使糖更大程度地轉化成酒精[13]。

2.2 總酚、總黃烷-3-醇、總黃酮、總花色苷

多酚類物質是葡萄酒中主要生物活性成分，主要存在于高等植物的器官內[14-16]。近些年來，由于多酚物質對人體具有明顯的抗氧化、抗逆、清除自由基及改善微循環等功效[4]，人們對葡萄酒中酚類物質的研究越加深入。根據碳環結構的不同，多酚分為類黃酮和非類黃酮類物質。其中類黃酮類物質包括花色苷及其衍生物(單體花色苷、vitisins、pinotins及portisins等)、黃烷醇類(黃烷-3-醇單體和原花色素)和黃酮醇類(楊梅酮、槲皮素和山柰酚等)，這是因為在苯環上的羥基和甲氧基的數量和位置存在差異。非類黃酮類物質是指不具有C6-C3-C6結構的物質，可分為酚酸(羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類)和芪類。其中酚酸這類小分子質量物質包括羥基苯甲酸(水楊酸、香草酸、沒食子酸及原兒茶素等)、水解單寧(沒食子單寧和鞣花單寧)和羥基肉桂酸(咖啡酸、香豆酸、阿魏酸及芥子酸等)；芪類中反式和順式白藜蘆醇占絕大多數。

酚類物質在葡萄酒中地位舉足輕重，它對葡萄酒的感官品質(顏色、苦味、澀味以及結構等)與保健作用具有重要影響[17-18]。為此，本研究檢測了西北部及中部不同產區的紅、白葡萄酒的多酚類物質組成，結果如表4所示。

表4 樣品多酚物質理化指標結果 單位：mg/L

根據結果得知，紅、白葡萄酒總酚含量分別為2 422～3 796 mg/L和269～520 mg/L；紅葡萄酒的總黃酮含量為1 455～2 233 mg/L，白葡萄酒的總黃酮含量為99～273 mg/L；紅、白葡萄酒中總黃烷-3-醇的含量分別為837～1 522 mg/L和30～104 mg/L；紅葡萄酒中總花色苷含量為66～201 mg/L，白葡萄酒中的總花色苷未檢出。結果表明，各多酚組分僅相當于紅葡萄酒的1/10，這可能與紅、白葡萄酒在釀造過程中的浸泡時間和溫度有關，與釀制工藝有關，對其多酚組成造成了以上影響。

從地域因素來分析，吐哈產區、天山產區等地處我國西北部，樣品多酚含量比其他產區高，黃酮和黃烷-3-醇含量尤為顯著，這與產區的氣候相關聯，例如日照時長、晝夜溫差及土地貧瘠度等。貧瘠土地可促進黃酮物質的合成，因為其能提供更多無機離子[19]。從品種因素來分析，紅葡萄酒的總酚、總類黃酮含量較高，白葡萄酒含量較低，這與前人報道相符[17]。據文獻得知，巴西產區的紅葡萄酒總酚含量為1 260～1 893 mg/L[15]，希臘產區的紅葡萄酒總酚含量為2 481 mg/L[16]，智利產區的紅葡萄酒總酚含量為2 133 mg/L[17]。通過試驗結果得知，我國西北部和中部產區紅葡萄酒總酚含量為2 422～3 796 mg/L，相比之下，我國西北部及中部產區葡萄酒多酚類物質含量較高。

2.3 單體酚

葡萄酒中多酚的組成較為復雜，為探索不同葡萄酒樣品間單體酚類別和含量差異，對樣品中單體酚物質定量分析。如圖1所示，測定的21種單體酚分別是在酒體中呈苦味和收斂性的感官特征、支撐酒體“骨架感”的黃烷醇類物質，分別為兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯；7種黃酮類物質(槲皮素、蘆丁、山奈酚、橙皮苷、楊梅素、柚皮素、香豆素)，主要來源于果皮，目的是減少組織被紫外線過度照射受損[20]，為葡萄酒提供黃色色調；10種來自果實和陳釀過程的酚酸類物質，包括原兒茶酸、丁香酸、水楊酸、沒食子酸、香草酸(對羥基苯甲酸類物質)、芥子酸、阿魏酸、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸(羥基肉桂酸類物質)；1種芪類(反式白藜蘆醇)，主要存在于葡萄的葉片和果皮，產生于果實收到脅迫時[21]，反式白藜蘆醇較為常見。

a-21種單體酚標準品；b-1號樣品圖1 21種單體酚標準品及1號樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 21 monomer phenolic standard substances and sample No.1

2.3.1 黃烷-3-醇

黃烷醇類物質在葡萄酒體中作用主要為呈苦味和收斂性[22]，影響著葡萄酒品質。試驗數據顯示，紅葡萄酒中黃烷-3-醇含量約為白葡萄酒的10倍，含量遠高于白葡萄酒，這與理化方法測定結果相同。黃烷-3-醇單體和原花色素為葡萄酒中黃烷醇類物質[22]，如表5所示，兒茶素和表兒茶素含量比表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量高，且部分酒樣未檢出表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯。不同產區紅、白葡萄酒間含量差異較大。黃烷醇物質主要存在于葡萄漿果的種子、果皮和果梗部分[21]，葡萄酒中含量差異應該源自于原料的情況和釀造工藝的不同，它們的組分差異和含量高低直接影響葡萄酒的陳釀潛力。

表5 葡萄酒黃烷-3-醇含量 單位：mg/L

2.3.2 黃酮醇

黃酮醇主要來自葡萄果皮，是酚類化合物中重要的一類，在發酵過程中滲入酒體，影響苦味和酒體顏色[23-24]，目前被廣為研究的是黃酮醇物質的輔色作用。黃酮醇類物質相較于其他多酚類物質含量較少，在紅葡萄酒中質量濃度<100 mg/L[24]，酒體中含量較高的苷元主要是楊梅素、槲皮素和山奈酚[25]。如表6所示，槲皮素在不同產區含量差異較為明顯，源于氧化、釀造過程中沉淀或釀造工藝等因素。總體來說，葡萄酒中黃酮含量與黃烷-3-醇相比，含量較少。

表6 葡萄酒黃酮醇含量 單位：mg/L

2.3.3 對羥基苯甲酸

無C6-C3-C6結構的物質被稱為非類黃酮類物質，按照結構不同分為酚酸和芪類。酚酸類物質主要參與氧化還原與褐變反應，主要影響感官評價與營養功效[25]。如表7所示，不同酒種及同酒種間對羥基甲酸含量差異顯著，這與不同產區的特性有關。紅葡萄酒和白葡萄酒中水楊酸含量均是最高的，這點與文獻中報道存在差異，可能成為西北部葡萄酒的一個特點。

表7 樣品中對羥基苯甲酸含量 單位：mg/L

2.3.4 對羥基肉桂酸

如表8所示，不同產區葡萄酒樣品中咖啡酸和芥子酸含量較高，阿魏酸含量較低，但白葡萄酒樣品在有未檢出現象葡萄酒中對羥基甲酸含量高于對羥基肉桂酸含量。阿魏酸和芥子酸與葡萄酒酒體色澤有密切的關聯，為輔色特性的化合物；其含量分別為總酚酸的1.01%、0.08%，對花色苷的維穩有重要作用。分析結果得知咖啡酸和對香豆酸的高含量來自肉桂酸酒石酸脂類分解，其輔色物質的特性影響著紅葡萄酒酒體顏色。

表8 樣品中對羥基肉桂酸含量 單位：mg/L

2.3.5 芪類

白藜蘆醇因其生物學活性一直備受消費者關注[26]，而反式白藜蘆醇是最重要的芪類。反式白藜蘆醇在葡萄酒中含量為1～30.0 mg/L[18]，它是葡萄受到外界脅迫(真菌感染、紫外照射)后的產物[26]，受葡萄種植條件、氣候狀況和災害程度等因素影響。如表9所示，紅、白葡萄酒間反式白藜蘆醇含量差距大，其中白葡萄酒中反式白藜蘆醇質量濃度<0.4 mg/L，紅葡萄酒中反式白藜蘆醇質量濃度為0.9～3.4 mg/L。

表9 樣品中芪類含量 單位：mg/L

2.4 抗氧化能力分析

葡萄酒的抗氧化功能深受消費者喜愛，通過葡萄酒對DPPH、ABTS+和羥自由基的清除能力來評估樣品的抗氧化能力。

圖2為西北部產區及中部產區樣品抗氧化能力值測定結果，樣品間抗氧化能力相差較顯著，這與原料的栽培管理、釀造工藝及陳釀工藝有很大的關系。由數據得知，紅、白2種葡萄酒間抗氧化能力差異十分明顯。紅葡萄酒樣品中抗氧化能力值為19 669～25 334 μmol/L Trolox當量，而白葡萄酒抗氧化能力值為1 352～2 457 μmol/L Trolox當量，僅為紅葡萄酒的1/10。各產區之間比較，和伊犁產區抗氧化能力較強，可能具有較高的保健功能。

2.5 葡萄酒多酚含量與抗氧化能力相關性分析

運用 SPSS 軟件對葡萄酒樣品主要的指標建立相關性分析表。如表10、表11所示。按照反應機理不同抗氧化反應分為電子轉移反應和氫原子轉移反應2種，原理為抗氧化劑通過轉移電子而使某些物質(金屬、羰基、自由基)被還原和抗氧化劑通過提供氫原子而清除某些自由基[27]。DPPH、ABTS+與羥自由基方法之間具有顯著相關性，與原理相符；葡萄酒樣品多酚成分含量(總多酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷)與抗氧化指標(DPPH、ABTS+、羥自由基)間，總多酚、總黃酮、與總黃烷-3-醇間呈極顯著正相關，且與抗氧化指標均具有極顯著正相關性；其他指標相關性不顯著。

對單體酚與各抗氧化指標結果進行分析，從單體酚層面，除原兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯與各抗氧化指標相關性不顯著，其他單體酚與各抗氧化指標均呈顯著相關；對抗氧化能力貢獻較大的依次為芥子酸、水楊酸、楊梅素、兒茶素、表兒茶素；從多酚類別分析得知，對抗氧化能力貢獻較大的依次為對羥基肉桂酸、芪類、對羥基苯甲酸、黃烷-3-醇、黃酮醇。

a-DPPH自由基;b-ABTS+自由基;c-羥自由基圖2 葡萄酒抗氧化能力圖Fig.2 Antioxidant capacity of wines

表10 葡萄酒中多酚成分與抗氧化活性相關性分析Table 10 Correlation analysis between polyphenols and antioxidant activity in wine

表11 葡萄酒中單體酚成分與抗氧化活性相關性分析Table 11 Correlation analysis of individual phenol and antioxidant activity in wine

3 結論

本研究以西北部產區(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)及中部產區(河北產區)葡萄酒為樣本，測定其多酚組成及抗氧化能力，分析樣品間差異性及相關性，探究影響抗氧化功效的單體酚物質，為葡萄種植及釀造提出參考建議。通過對酚類物質含量、DPPH、ABTS+及羥自由基清除率的測定，發現西北部產區樣品酚類物質含量高，且種類豐度較高；焉耆與伊犁產區葡萄酒抗氧化能力較高。相關性分析表明，DPPH、ABTS+和羥自由基的清除率3種方法具有極顯著正相關性；對抗氧化能力貢獻較大的多酚類物質依次為對羥基肉桂酸、芪類、對羥基苯甲酸、黃烷-3-醇、黃酮醇，對抗氧化能力貢獻較大的單體酚依次為芥子酸、水楊酸、楊梅素、兒茶素、表兒茶素。

對結果進行分析可知，西北部產區及中部產區葡萄酒整體水平較高，說明近年來我國葡萄酒市場正在逐步走向完善，品質也在不斷提升，提升了消費者對國產葡萄酒的自信心。目前葡萄酒的品質主要依靠專業品酒師的品評，受專業水平和主觀因素影響，本研究主要依據多酚物質豐度、含量及抗氧化能力對葡萄酒進行評價，是一種新型的評價方法，可為葡萄酒市場提供新的參考。