大豆蛋白/蛋清蛋白復合凝膠特性的研究

楊娟,羅瑋倩,何曼源

1(嶺南師范學院 食品科學與工程學院，廣東 湛江，524048)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

大豆蛋白是一種性價比高、富有營養的產品。雖然我國食用豆制品已有悠長歷史，但由于大豆蛋白屬于球蛋白，其結構保守，聚集的驅動力多以疏水作用、氫鍵等物理相互作用為主，聚集體結構無序，凝膠強度不足，二硫鍵含量低，使得制備的大豆蛋白凝膠等食品易出現口感粗糙，滋味不足，結構松散的現象，由大豆蛋白制成的凝膠食品不能提供具有彈性的、堅韌的口感質構[1-4]。解決該問題可通過選擇性混合二硫鍵含量豐富的蛋清蛋白于其中，制出一種高蛋白、風味口感俱佳的植物蛋白和動物蛋白混合物。蛋清蛋白富含二硫鍵，可形成以共價鍵支撐的凝膠網絡，賦予凝膠良好的口感質構及持水性[5-7]。利用其成膠特性，使其作為大豆蛋白熱致凝膠過程中游離巰基的供體，使復合體系可形成更多二硫鍵，最終達到改善大豆蛋白凝膠結構和質構的目的。本文研究大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)與蛋清蛋白(egg albumin，EA)及其復合體系間的差異，利用萬能材料機考察其成膠性能、掃描電子顯微鏡(scanning electronicmicroscope，SEM)觀察其微觀結構并分析其持水性能，了解不同條件下單一大豆蛋白體系和大豆蛋白/蛋清蛋白復合體系凝膠的狀態，從而為選擇性混合大豆蛋白與蛋清蛋白的進一步實驗提供思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛋清蛋白，Sigma公司；低溫脫脂大豆粕，山東御馨生物科技公司；Folin-酚試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設備

CR22G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機，德國Christ公司；RW 20頂置式攪拌器、T25分散均質機，德國IKA公司；Zeiss EVO18臺式掃描電子顯微鏡，德國Carl Zeiss；Genesys 10 s分光光度計，美國Therom Fisher公司；5943萬能材料試驗機，美國Instron公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用WANG等[8]的方法制備大豆分離蛋白。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

通過SDS-PAGE考察大豆蛋白及蛋清蛋白原料的蛋白組成[9-10]。配制分離膠緩沖液(1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8)、濃縮膠緩沖液(0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8)、30%(體積分數)單體貯液、10%(質量分數)SDS、電泳緩沖液。分離膠由10 mL分離膠緩沖液、17 mL 30%單體貯液、0.4 mL 10% SDS、12.4 mL去離子水加250 μL 過硫酸銨(ammonium persulfate,AP)后迅速搖晃，再迅速加入25 μL 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)組配。濃縮膠由5 mL濃縮膠緩沖液、3.4 mL 30%單體貯液、0.2 mL 10%SDS、11.4 mL去離子水、加120 μL AP后迅速搖晃再加10 μL TEMED組配。Marker上樣量7μL，蛋白樣品(質量濃度2.5 mg/mL)上樣量10 μL。

1.3.3 蛋清蛋白溶解性

采用Folin-酚試劑盒進行測定。

1.3.4 成膠性能測定

配制8 mL 2%～12%(體積分數)的蛋清蛋白溶液、8 mL 10%～15%(體積分數)的SPI蛋白溶液、8 mL 10%～15%的大豆蛋白/蛋清蛋白復合溶液(質量比為4∶1)并調至pH 5.5，置于95 ℃水浴30 min，冰水冷卻至室溫。將凝膠樣品切成長度為10 mm、直徑為14.36 mm的截面平整的圓柱體，利用萬能材料機測定質地剖面分析(texture profile analysis,TPA)曲線，選用直徑為25 mm的探頭，速度均為1 mm/s，形狀采用絕對斜線段，凝膠壓縮強度為30%，首次壓縮后探針停滯保持1 s后進行二次壓縮，TPA曲線最高峰點對應凝膠硬度[4,11]。另考察pH 7.0和pH 5.5時的凝膠成膠性能以及等電點成膠的優勢。

1.3.5 持水性測定

(1)

1.3.6 微觀結構

配制60 mL 5%(體積分數)戊二醛溶液，混合60 mL 40 mmol/L的磷酸緩沖液作為固定液使用。將制好的凝膠固定過夜，然后用20 mmol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，以30%～100%不同體積分數的乙醇對凝膠進行梯度脫水10 min并切薄片，置于導電膠上，噴金處理后在掃描電鏡10 kV條件下觀察[13-14]。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的組成

經分析，2種蛋白質條帶對應的類別如圖1所示。

圖1 SPI與EA的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE image of SPI and EA

2.3.2 蛋清蛋白溶解性

蛋清蛋白于pH 8.0條件的溶解度最高，隨著pH下降，在pH 5.0時溶解度達到最低。呈現典型的蛋白質溶解度曲線。SPI在pH 4.5處達到等電點，二者等電點接近。選擇pH 5.5即接近兩者等電點處作為成膠條件可使凝膠強度相對較強[15-16]。

圖2 pH 2～8時100 μg/mL EA溶液溶解度Fig.2 Solubility of 100 μg/mL EA solution at pH 2-8注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3.3 蛋清蛋白及大豆蛋白/蛋清蛋白復合體系成膠性能

2%～12%的EA、10%～15%的SPI和SPI+EA加熱后所形成的凝膠形態如圖3所示。

a-5%～12%的EA凝膠形態;b-10%～15%的SPI凝膠形態;c-10%～15%SPI+EA凝膠形態圖3 蛋白濃度為2%～12%的EA、蛋白濃度為10%～15%的SPI和SPI+EA凝膠形態Fig.3 Morphology of EA gel with 2%-12% protein content,SPI gel with 10%-15% protein content and SPI+EA composite gel

EA溶液，體積分數為2%時難以成膠。溶液體積分數為4%可形成結構仍然不緊致凝膠，無法切塊后直立。溶液體積分數為5%及以上，凝膠結構和質地良好且強度隨蛋清蛋白濃度的增加逐漸升高[16-17]。10%～15%的SPI溶液加熱后可形成完好凝膠，但凝膠結構仍不緊致。凝膠結構強度隨大豆蛋白濃度增加逐漸升高，形狀更加完整，質地愈來越硬。10%～15%的SPI+EA復合溶液加熱后形成的凝膠結構強度隨著SPI+EA蛋白濃度的增加逐漸升高，其質地也越來越硬。相比于單純的大豆蛋白凝膠，同一濃度復合凝膠結構的完整性及質地有明顯的優勢。TPA曲線分別對應5%～12%的蛋清蛋白凝膠。溶液濃度為6%及以上時，凝膠硬度逐漸上升，逐漸形成了結構良好、完整的圓柱體，即凝膠硬度隨著蛋清蛋白濃度的增加而上升，趨勢明顯。同一濃度和處理條件下，添加了蛋清蛋白后的復合體系形成的凝膠結構更緊密，質地硬度更高，成膠性能大大提升。

圖4 蛋白濃度為5%～12%的EA、蛋白濃度為10%～15%的SPI以及SPI+EA凝膠硬度Fig.4 Hardness of EA gel with 5%-12% protein content, SPI gel with 10%-15% protein content and SPI/ EA composite gel

2.3.4 蛋清蛋白持水性

不同濃度蛋清蛋白間的持水性能差異如圖5所示。在5%～12%，隨EA溶液濃度的增加，其持水性能提高。更多蛋白加入到凝膠網絡中帶來更多的親水基團，將更多的水束縛在網絡內。隨著蛋白濃度增加，網絡結構增強，網絡內可承載水分量增加。隨著SPI和SPI+EA復合體系濃度的增加，體系的持水性逐步加強。相比于同一濃度的單一SPI溶液體系，復合體系的持水性具有優勢，蛋清蛋白的加入不僅能夠增加二硫鍵來改善蛋白凝膠的硬度，還能鎖住更多的水分。

圖5 蛋白濃度為5%～12%的EA、5%～12%的SPI及SPI+EA凝膠持水性Fig.5 Water holding capacity of EA gel with 5%-12% protein content, SPI gel with 10%-15% protein content and SPI+EA composite gel

2.3.5 蛋白凝膠微觀結構

通過SEM觀察到的微觀結構如圖6所示。凝膠網絡是由多個聚集體小球組裝成凝膠的三維網絡，在濃度較低時，EA復合凝膠疏松，孔隙和顆粒更多，在濃度較高時，蛋白體系形成了結構緊密的狀態。隨著蛋白體系濃度的增加，凝膠微觀結構從疏松過渡為致密，凝膠機械強度由此提升，顆粒數的明顯降低和越來越致密網絡導致了凝膠持水性的提高。濃度相同時，在濃度較低時，純SPI凝膠較SPI+EA復合凝膠疏松，孔隙和顆粒更多，在濃度較高時，2種蛋白體系都形成了結構緊密的狀態。蛋白濃度低時，SPI網絡是顆粒球堆砌起來，而加了蛋清蛋白以后，有了更多共價鍵參與網絡的構建，EA融入了SPI網絡，形成了更清晰的網絡結構，使蛋白網絡更致密，因而改善凝膠的硬度和持水性。

a-EA 5%;b-EA 6%;c-EA 7%;d-EA 8%;e-EA 9%;f-EA 10%;g-EA 11%;h-EA 12%;i-SPI 10%;j-SPI+EA 10%;k-SPI 11%;l-SPI+EA 11%;m-SPI 12%;n-SPI+EA 12%;o-SPI 13%;p-SPI+EA 13%;q-SPI 14%;r-SPI+EA 14%;s-SPI 15%;t-SPI+EA 15%圖6 蛋白濃度為5%～12%的EA以及10%～15%的SPI與SPI+EA微觀結構Fig.6 Microstructure of SPI gel, SPI+EA composite gel with 10%-15% protein content and EA gel with 5%-12% protein content

2.3.6 不同pH下蛋白體系成膠性能

對比10%濃度下不同pH和不同構成的蛋白溶液加熱后形成的凝膠的成膠性能，結果如圖7所示。

10% pH 7.0 EA溶液熱處理可以形成質地良好的凝膠，相比于相同條件下SPI與EI復合溶液所形成的凝膠硬度更高，主要源于蛋白在相對較高pH下，熱處理可形成更多二硫鍵，所形成凝膠的質地結構更好，而pH較低時，二硫鍵則形成得少[18]。pH 7.0的SPI+EA復合溶液的持水性效果最佳，可見混合SPI可以提高蛋白體系的持水性能。選擇pH 5.5作為凝膠條件，接近兩者等電點，可以使凝膠的強度相對較強，但持水性比pH 7.0時相對較差，因為此時接近等電點，蛋白與水的相互作用相對弱一些。10% pH 7.0時SPI+EA復合凝膠相比于10% pH 7.0相同條件的EA凝膠更加致密、平整，因為形成了完整、質地緊致的透明狀凝膠，水分含量極高，蛋白固體沉淀很少。在10% pH 5.5時，SPI+EA復合凝膠結構相比之下疏松許多，顆粒數明顯增加。

a-硬度、凝膠形態；b-持水性、微觀結構圖7 蛋白凝膠硬度、蛋白凝膠形態、持水性和微觀結構Fig.7 Hardness, gel morphology, water holding capacity and microstructure of protein gel

3 結論與討論

純大豆蛋白形成的凝膠二硫鍵含量很少，凝膠結構疏松，與蛋清蛋白相比，相差比較遠，在大豆蛋白溶液中添加蛋清蛋白溶液(質量比為4∶1)，可以增加所形成的凝膠中含有的二硫鍵，從而增加凝膠的硬度，使其擁有良好的質地，微觀形貌體現了凝膠結構從疏松過渡為致密，顆粒數明顯降低。此外，添加了蛋清蛋白所形成的凝膠的持水性能也有所改善。

蛋白在相對較高pH下，熱處理可形成更多二硫鍵，而pH較低時，二硫鍵則形成得少[19-20]。當pH 7.0時10%純大豆蛋白溶液無法形成凝膠，當添加了蛋清蛋白質之后可以形成具有良好結構和持水性更好的凝膠。隨著蛋白濃度增加，蛋白質相互接觸的機會增加，疏水作用增強，更易形成三維網絡結構，且結構的強度和持水性能隨之增加。利用蛋清蛋白作為大豆蛋白熱致凝膠過程中游離巰基的供體，可使復合體系可形成更多二硫鍵，在提升硬度的同時增加也能其持水性，賦予凝膠良好的質構。