產α-環糊精葡萄糖基轉移酶的菌株篩選、鑒定與酶學性質的初步研究

陶大煒，寧喜斌,2,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估試驗室(上海)，上海，201306)4(國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海)，上海，201306)

環糊精 (cyclodextrin，CD)通常由6個以上D-吡喃葡萄糖基通過α-1,4-糖苷鍵相連而成的，由于葡萄糖基個數的不同，又被分為α-CD、β-CD和γ-CD這3種，它們是應用最廣泛的環糊精，也稱基礎環糊精，其中α-CD有6個葡萄糖基，β-CD有7個，而γ-CD有8個[1]。環糊精分子結構的外面部分具有親水的特點，因為含有親水基團，分子結構的內部相對就是疏水的，正因為其分子結構特殊，從而可以包絡不同化合物，以改變它們物理和化學等性質，因此環糊精可以被廣泛并且有效的利用，并運用于如食品工業、化妝品、藥品、環保、化學分析與檢測等諸多領域里[2-5]。

環糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)可作用于淀粉等，使底物的葡萄糖基團發生轉移，從而獲得環糊精。CGTase可以催化4種不同的反應：歧化反應、環化反應、偶合反應和水解反應(其中前3種為3種轉糖基反應)[6]。在工業應用中，主要是利用CGTase的環化反應作用，與淀粉等發生反應后生產環糊精。

目前大致可歸納為篩選產酶野生菌株進行發酵生產、結合基因庫對產酶菌株的基因進行克隆表達、使用蛋白質工程技術對已知的基因片段進行改良這3種方法獲取CGTase，其中產酶野生菌株的篩選是直接有效的，同時也是其他方法的基礎[7]。在自然界中有很多菌株可生產CGTase，它們的分布很廣泛，既存在于火山、沙石、溫泉、油井等[8-11]環境，還存在于富含淀粉土壤的玉米、薯類、土豆、南瓜、甘蔗等[12]的種植地，同時這些野生菌株的種類眾多。

國內外學者主要致力于篩選高產且性質穩定的野生菌株、提高酶的熱穩定性及pH穩定性、優化菌株的產酶條件提高酶活性、物理化學誘變與在工程菌株中的異源表達提高酶活性等。MARTINS等[8]篩選出的包含黏瓊脂芽孢桿菌(Bacillusagaradhaerens)所產CGTase酶活性較低，僅有0.31 U/mL，需要通過產酶條件優化等方式提高其酶活性。COELHOSL等[12]篩選出的芽孢桿菌(Bacillussp.)產β-CGTase的熱穩定性較差，限制了其在工業上的應用能力。張佳瑜等[13]將來自于浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)的產α-CGTase酶的基因進行克隆，并優化產酶條件，酶活性從1.9 U/mL提高到4.5 U/mL，說明基因的克隆表達和產酶條件優化有助于提高酶活性。雷新輝[5]篩選出的產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)產α-CGTase酶活性為0.64 U/mL，經復合誘變處理后，活性提高到5.68 U/mL，說明誘變育種對于菌株的產酶活性有很大影響。

為了使環糊精的工業化生產能夠實現，同時降低成本，找到產酶活性高、穩定性良好的野生菌株是關鍵。本試驗從上海浦東新區新場鎮某農場馬鈴薯、紅薯、玉米種植田分離、篩選產α-CGTase的菌株，對其中1株酶活性較高的菌株進行形態學特征、生理生化試驗鑒定和16S rRNA序列比對分析，對其酶學性質進行了初步研究，以期為進一步工業化開發利用性狀穩定且高產α-CGTase的菌株提供借鑒，旨在為工業生產α-CGTase及其應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

2019年8月于上海浦東新區新場鎮某農場馬鈴薯、紅薯、玉米種植田(121.658 766 °E，31.052 923 °N)采集樣品，用無菌采樣器采集3～10 cm深的土壤樣品，樣品采集后放入無菌取樣袋，并在2 h內送回試驗室進行處理分析。

1.1.2 試劑

PCR擴增試劑盒、酵母浸粉、DNA提取試劑盒、可溶性淀粉、蛋白胨等, 上海生工生物工程股份有限公司；α-CD, Sigma(上海)公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O,國藥集團化學試劑有限公司；Na2CO3，上海柯靈斯試劑有限公司；酚酞、甲基橙，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

初篩培養基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母浸粉5，瓊脂15，NaCl 5，Na2CO31，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，酚酞 0.3，甲基橙 1，自然pH，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

復篩培養基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母浸粉5，NaCl 1，Na2CO30.5，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.0，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

發酵培養基及種子培養基，同復篩培養基。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；THZ-300C恒溫培養搖床、GHP-9 270隔水式恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HWT-6B恒溫水浴箱，天津市恒奧科技發展有限公司；CX41RF顯微鏡，東京奧林匹斯公司；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；PTC-200 PCR儀、GelDoc XR凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產α-CGTase菌株的初篩

分別取土豆、紅薯、玉米種植田土樣10 g加入到90 mL含玻璃珠的無菌水中，充分振蕩40 min。取1 mL 上述混合液加入99 mL營養肉湯，37 ℃，170 r/min條件富集培養24 h。使用生理鹽水進行梯度稀釋，并將稀釋液(100 μL)均勻涂布于初篩培養基，37 ℃培養48 h。以出現黃色透明圈作為篩選標準，將篩選出的菌株分離純化，4 ℃條件下進行保藏。

1.3.2 產α-CGTase菌株的復篩

粗酶液的制備：發酵培養基裝液量100 mL/250 mL，菌種接種量為4%的種子培養基，37 ℃、170 r/min搖床培養48 h，于10 000 r/min離心10 min后所得上清液即為粗酶液。

α-CGTase活力的測定：采用甲基橙褪色法測定酶的環化活力。在酸性(pH 1.1～1.4)條件下，α-CD與甲基橙發生反應，形成絡合物，使溶液的吸光度下降。在一定范圍內，吸光度的下降與α-CD的濃度存在著線性關系[4,14]。用50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0)配制40 g/L的可溶性淀粉溶液做底物，取0.9 mL于試管中，加入適當稀釋的粗酶液0.1 mL，均勻混合。50 ℃水浴反應10 min，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL中止反應。再加入0.1 mmol/L 甲基橙溶液1 mL，于20 ℃靜置15 min， 507 nm測定吸光度[15]。對應α-CD標準曲線計算濃度，1個酶活單位(U)定義為上述條件下1 min生成1 μmol α-CD所需的酶量。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態學鑒定

觀察純化后菌株的菌落形態。挑取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態。

1.4.2 生理生化鑒定

根據相關文獻[16-17]，對菌株進行生理生化鑒定試驗，主要包括水解淀粉試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原、接觸酶、分解酪氨酸、甘露醇、葡萄糖產酸產氣、阿拉伯糖、棉籽糖利用等。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析和構建系統發育樹

根據細菌總DNA提取試劑盒說明提取菌株DNA。PCR擴增采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增產物送至上海生工生物公司測序，登入NCBI(National Center for Biotechnology Information)，BLAST比對測序結果，獲取同源性高的菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA-X軟件中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹，并對其分析鑒定[18]。通過Bankit將菌株鑒定的16S rRNA基因的部分序列向GenBank申請登錄號(GenBank Accession)。

1.5 酶學性質初步研究

1.5.1 酶的最適作用溫度

用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0)稀釋粗酶液和甲基橙溶液，設定20、30、40、45、50、55、60、70、80 ℃，9個反應溫度。按照上述不同反應溫度的條件，對各反應溫度條件下的樣品分別測定其α-CGTase活性，將酶活性最高者定義為100%，并計算相對酶活性。

1.5.2 酶的熱穩定性

取適量無菌粗酶液分裝于離心管，分別在40、45、50、55、60 ℃，5個保溫溫度條件下分別保溫不同時間。按照上述不同保溫溫度和時間的條件，對各保溫條件下的樣品分別在不同保溫時間下分別測定其α-CGTase活性，將未進行保溫處理的酶活性定義為100%，并計算相對酶活性。

1.5.3 酶的最適作用pH

分別配制濃度為50 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0～5.0)、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0～8.0)、甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.0～10.0)，Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH 11.0～12.0)[15]。設定pH 3.0～12.0，10個反應pH。按照上述不同反應pH的條件，對各反應pH條件下的樣品分別測定其α-CGTase活性，將酶活性最高者定義為100%，并計算相對酶活性。

1.5.4 酶的pH穩定性

先將粗酶液與不同pH值(3.0～12.0)的緩沖液混合，放置處理1、2 h。按照上述不同反應pH和處理時間的條件，對各pH處理條件下的樣品分別在1、2 h下分別測定其α-CGTase活性，將未經過不同pH緩沖液處理的酶活性定義為100%，并計算相對酶活性。

1.5.5 金屬離子對酶活力的影響

配制濃度為1 mmol/L的不同金屬離子(K+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Co2+)溶液，分別取適量與粗酶液混勻。對添加不同金屬離子的樣品分別測定其α-CGTase活力，將未添加金屬離子的酶液作為對照組，定義其酶活力為100%，并計算各組相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

初篩培養基因加入酚酞而呈紅色，菌株所產α-CGTase可降解培養基中的可溶性淀粉形成環糊精，環糊精可包埋酚酞，使菌株周圍呈現黃色透明圈，透明圈越大，說明菌株產α-CGTase越多[19]。據此從土壤中篩選出117株產α-CGTase的菌株，從中挑選出透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株30株進行發酵產酶培養復篩，通過甲基橙褪色法分別測定酶活性，獲得酶活性較高(表1)菌株TLLY7。本試驗將菌株TLLY7作為出發菌株，進行后續試驗，其酶性活為1.35 U/mL，這與其他學者篩選出的野生菌株的酶活性相似，例如陳龍然[4]篩選出的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)產α-CGTase的酶活性(0.95 U/mL)、陳龍軍等[20]篩選出的嗜熱芽胞桿菌(Gebacilliussp.)產α-CGTase的酶活性(0.66 U/mL)、葉學軍[21]篩選出的地芽孢桿菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus)產α-CGTase的酶活性(1.29 U/mL)，低于他們進行復合誘變、產酶條件優化和基因的克隆與表達等方法后的酶活性，分別為2.28、5.3和6.18 U/mL，這說明篩選出活性高的野生菌株只是完成了第1步，只依靠野生菌株發酵有很大的局限性，需要結合其他方法提高酶活性，才有更大的工業應用潛力。

表1 產α-CGTase部分菌株的篩選結果Table 1 Screening results of α-CGTase producing strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種的形態觀察

菌株TLLY7為革蘭氏陽性，菌體成桿狀，有芽孢產生。圖1-a為菌株TLLY7在初篩培養基上的菌落透明圈形態。圖1-b為菌株TLLY7平板菌落形態，菌落呈黃白色，圓形隆起，不光滑，不透明，大小2～5 mm，有褶皺，邊緣整齊。圖1-c為菌株TLLY7經革蘭氏染色后在油鏡下的觀察圖。

a-初篩培養基菌落透明圈形態；b-平板菌落形態；c-細胞顯微形態圖1 菌株 TLLY7 菌落形態和在油鏡下的細胞形態Fig.1 The colony morphology and cell morphology under oil immersion lens of strain TLLY7

2.2.2 生理生化鑒定

根據相關文獻[16-17]，對菌株TLLY7進行生理生化鑒定。表2為菌株TLLY7的生理生化鑒定結果。

表2 菌株TLLY7的生理生化特征Table 2 Biochemical characteristics of strain TLLY7

2.2.3 16S rRNA鑒定及系統發育樹構建

圖2為菌株TLLY7的PCR產物電泳條帶圖。由圖2可知菌株TLLY7經PCR擴增后，條帶約1 500 bp，擴增產物經測序得到的16S rRNA序列為1 480 bp，登錄NCBI官網上傳序列并進行BLAST比對，結果顯示高于Ident值96%的菌株有100多株，說明較多菌株與菌株TLLY7序列相似，將它們序列下載后通過MEGA-X的NJ法構建系統發育樹(圖3)[18, 22]。由圖3可發現菌株TLLY7和P.maceransNBRC 15 307T(NR 112729.1)在同一分支上，其相似性高達98.91%，說明兩者同為類芽孢桿菌屬，且Bootstrap檢驗值為100，說明發育樹所表示的2種菌株之間的進化關系可信[23]。結合形態學、生理生化鑒定可確定菌株TLLY7為浸麻類芽孢桿菌(P.macerans)。將菌株TLLY7的核酸序列通過Bankit向GenBank申請的登錄號為MT 705866。

圖3 基于16S rRNA序列分析的菌株TLLY7的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain TLLY7 based on 16S rRNA sequence analysis

2.3 菌株TLLY7酶學性質初步研究

2.3.1 α-CD標準曲線的繪制

根據標準方法繪制α-CD標準曲線。線性回歸方程為y=0.546 1x-0.000 8，R2=0.999 1，表明線性良好。

2.3.2 酶的最適作用溫度

圖4為溫度對TLLY7所產α-CGTase活性的影響。當反應溫度在20～50 ℃，酶活性不斷升高，從30 ℃開始酶活性升高的很快。溫度高于50 ℃，酶活性開始下降。尤其是溫度高于60 ℃后，酶活性下降的很快，在80 ℃時酶活性僅15%。溫度在40～60 ℃，酶活性保持在80%以上。所以酶的最適作用溫度為50 ℃，是中溫酶。該酶的最適反應溫度低于張曉磊[19]從黃海海域中篩選出的包含黏瓊脂芽孢桿菌所產α-CGTase的最適反應溫度(55 ℃)，低于張昌志[24]從羅漢果中篩選出的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)所產β-CGTase的最適反應溫度(60 ℃)，具有節約工業應用的能源，提高發酵效率的潛力。

圖4 溫度對TLLY7所產α-CGTase活力的影響Fig.4 Effects of temperature on the α-CGTase produced by TLLY7

2.3.3 酶的熱穩定性

圖5為溫度對TLLY7所產α-CGTase熱穩定性的影響。在40 ℃下保溫2 h酶活性保留82%，保溫6 h保留30%的酶活性。在45 ℃保溫1 h酶活性保留90%，保溫5 h保留30 %酶活性。在50 ℃保溫1.5 h，酶活性保留50%。在55 ℃保溫0.75 h酶活性喪失50%。在60 ℃保溫1 h酶活性保留28%。陳龍然[4]從淀粉廠泥土中篩選出的地衣芽孢桿菌所產α-CGTase在60 ℃保溫1 h酶活性保留17%。本試驗所產α-CGTase熱穩定性相對較好，但熱穩定性仍需要提高。因為酶的熱穩定性不足會限制酶的工業化應用，所以還需要進行試驗提高酶的熱穩定性。

圖5 溫度對TLLY7所產α-CGTase穩定性的影響Fig.5 Effects of temperature on the stability of α-CGTase produced by TLLY7

2.3.4 酶的最適作用pH

圖6為pH對TLLY7所產α-CGTase的影響。pH 3.0～4.0，酶活力很低。pH 4.0～6.0，酶活性升高的很快。pH>6.0，酶活性不斷下降。pH 12.0時，酶活性僅5%。表明本試驗所產α-CGTase的最適作用pH值為6.0，是弱酸性酶。

圖6 pH對TLLY7所產α-CGTase活力的影響Fig.6 Effects of pH on the α-CGTase produced by TLLY7

2.3.5 酶的pH穩定性

圖7為pH對TLLY7所產α-CGTase穩定性的影響。在pH 6.0～8.0，處理1 h酶活性保留95%以上，處理2 h酶活性保留90%以上。pH值<6.0或>8.0，酶活性明顯下降。pH 3.0和12.0處理1 h分別保留9%和11%酶活性，處理2 h酶幾乎失活。該酶在pH 10.0處理1 h保留77%酶活性。曹冬梅[25]從長白山溫泉泥土中篩選出的高溫芽孢桿菌所產β-CGTase在pH 10.0處理1 h保留60%酶活性。本試驗的pH穩定性相對較好，具有更寬pH范圍的應用前景。

圖7 pH對TLLY7所產α-CGTase穩定性的影響Fig.7 Effects of pH on the stability of α-CGTase produced by TLLY7

2.3.6 金屬離子對酶活的影響

由圖8可知，對酶有不同程度的促進作用的是Zn2+、Mn2+和Ca2+，而對酶的促進作用最強的是Ca2+，相對酶活性約為空白對照的1.25倍。對酶有不同程度的抑制作用的是Cu2+、Fe2+和Co2+，其中對酶的抑制作用最強的是Cu2+，酶活性被抑制33%左右，可能由于離子結合蛋白的作用區域而抑制酶活。K+、Mg2+對酶活力的影響不是很明顯。這與國內外學者篩選的菌株所產α-CGTase的性質相似，具有參考意義[26-27]。

圖8 金屬離子對α-CGTase活力的影響Fig.8 Effects of metal ions on the α-CGTase activity

3 結論與討論

本試驗利用甲基橙-酚酞平板法和甲基橙褪色法從上海浦東新區新場鎮某農場土豆、紅薯、玉米種植田分離出1株高產α-CGTase的菌株TLLY7，16S rRNA測序分析其基因序列，經BLAST比對后構建系統發育樹，結合形態學特征、生理生化鑒定后確定該菌株為浸麻類芽孢桿菌，命名為P.maceransTLLY7。將菌株TLLY7的核酸序列通過Bankit向GenBank申請的登錄號為MT 705866。

菌株TLLY7產α-CGTase的酶活性為1.35 U/mL，酶學性質的初步研究表明，50 ℃、pH 6.0為該酶的最適反應條件，為弱酸性中溫酶。該酶在40～45 ℃保溫1 h保留90%以上的酶活性，在60 ℃保溫1 h保留27%酶活性，pH 6.0～9.0處理1 h保留95%以上的酶活性，處理2 h保留90%以上的酶活性，熱穩定性和pH穩定性較好。Zn2+、Mn2+和Ca2+對酶有促進作用，Cu2+、Fe2+和Co2+對酶有抑制作用。其中Ca2+對酶的促進作用最強，Cu2+對酶的抑制作用最強。K+、Mg2+對酶活性的影響作用較小。

由于環糊精具有特殊的分子結構，可以包絡不同化合物，改變它們理化性質，目前被應用到了多個領域，例如在食品領域中可以達到抗氧化、保護色素等效果，使使提高食品的貯藏時間、改善食品的保存；在醫藥領域中可以改變藥物的性質使得藥物刺激減少、提高藥物的穩定性和降低毒副作用等效果，使藥品更能被人們接受，還可被應用于化妝品、環保、化學分析與檢測等諸多領域，因此對CGTase的產酶菌株進行分離純化和酶學性質的研究是很有意義的[5]。本試驗篩選出的產α-CGTase野生菌株可為未來的工作奠定基礎，也為酶的分離純化與工業化應用提供了依據。