山西老陳醋醋酸發酵過程中優良產酸菌株的篩選及鑒定

邢曉瑩，劉毅，張懷敏，李江涌，王如福*

1(山西農業大學 園藝學院，山西 晉中，030801)2(太原師范學院 生物系，山西 晉中，030619) 3(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷，030801)

傳統食醋釀造法主要有固態發酵法和液態發酵法，固態發酵法以中國的山西老陳醋[1]、鎮江香醋[2]和四川麩醋[3]為代表，液態發酵法以意大利香醋[4]、西班牙雪利醋[5]等為代表。不同釀造工藝釀制而成的食醋風味也有較大差異。液態深層發酵工藝釀制的食醋，由于使用純種的醋酸菌進行發酵，食醋中的有機酸種類、風味物質等相對單一，產酸以乙酸為主，風味物質主要是乙酸乙酯，產品酸味刺鼻、風味寡淡[6]。固態發酵食醋多采用開放式的發酵工藝，主要釀造微生物除醋酸菌外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等，它們經代謝直接產生或其代謝物通過合成作用形成多種物質，如醇類、酯類、有機酸、醛類、烯萜類等，不同的香氣物質組合在一起，共同賦予了食醋復雜而獨特的風味[7-10]。

山西老陳醋醋酸發酵過程中的微生物大都具有特定的功能，通過微生物的代謝作用產生眾多的食醋風味物質，為成品食醋特有風味的形成提供必要的基礎，如醋酸菌可將乙醇轉化為乙酸，是山西老陳醋醋酸發酵階段的主要產酸微生物，其性能直接影響到食醋的產量和品質。酸味是山西老陳醋的主要呈味物質，成品食醋的主體成分除乙酸外還有乳酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸，而這些物質與乳酸菌有密不可分的關系。本研究以山西老陳醋的醋醅為樣品，從中分離出產酸微生物，并對產酸性能優良、環境耐受性好的菌株進行篩選，為將來通過多種微生物菌劑優化食醋生產工藝、提高原料利用率、豐富食醋釀造的菌種資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集地點：山西老陳醋集團有限公司醋化車間(山西，晉中)。

采樣方法：在發酵缸的4個頂點以及中心位置，采集距離醋酸發酵缸表面20 cm處的醋醅100 g左右。跟蹤采集同批次5個發酵缸的醋醅樣本，并將其充分混勻，然后通過四分法舍去多余的醋醅，最終將300～500 g醋醅樣品收集于已滅菌的自封袋中，冷藏帶回實驗室后進行產酸菌株的分離。

采樣設計：如表1所示，跟蹤取樣同一批次正常發酵的醋醅，發酵周期9 d，隔天在翻醅后取樣，分別標記為AAF1、AAF3、AAF5、AAF7、AAF9。

1.2 試劑與儀器

MRS瓊脂培養基、無水葡萄糖、酵母膏、無水乙醇、瓊脂、濃鹽酸、CaCO3、NaOH、NaCl,所用試劑均為分析純。

表1 山西老陳醋醋醅樣品的采集時間及其編號Table 1 Sampling time and number at acetic acid fermentation stages of Shanxi aged vinegar

Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；DL-CJ-1ND型無菌超凈工作臺，北京東聯哈爾濱儀器設備有限公司；LS-35LJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療設備有限公司；ZQPL-200型立式恒溫振蕩培養箱，天津萊玻特瑞設備有限公司；Nano Drop 2000c核酸濃度測定儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；UVP凝膠成像系統， 英國Ultra-Violet Products有限公司；5424高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；7500實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；CX41生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產酸菌的分離、純化[11]

取10 g混勻樣品放入裝有玻璃珠和已滅菌的90 mL無菌生理鹽水的三角瓶(250 mL)中，振蕩20 min，即得到樣品10-1稀釋液，取5支已滅菌裝有9 mL無菌生理鹽水的試管，依次制成10-2～10-6稀釋液，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的稀釋液0.1 mL，涂布于篩選培養基上(質量分數1%葡萄糖、1%酵母膏、2%CaCO3、2%瓊脂，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min后加入體積分數3%的無水乙醇)。將平板倒置于37 ℃恒溫培養箱培養2～3 d，挑取長勢良好、分布密度大且形態不同的單菌落進行純化。將經過2～3次純化后的菌株接種于斜面培養基中，37 ℃恒溫培養18～24 h，置于4 ℃冰箱中保存。對于需要長期保藏的菌株，可采用安瓿管甘油-70 ℃保藏法。

1.3.2 產酸定量試驗

1.3.2.1 醋酸菌

以惡臭醋酸桿菌(Acetobacterrancens)AS1.41為對照菌株，采用酸堿滴定法[12]對分離獲得的醋酸菌進行產酸量(以醋酸計)測定，3次重復，取平均值，同時做空白滴定。酒精轉化率計算[13]如公式(1)所示：

(1)

式中：產酸量，g/L；酒精的體積分數轉換成質量濃度計算，g/L。

1.3.2.2 乳酸菌

乳酸菌的產酸量測定方法同醋酸菌。

1.3.3 環境耐受性試驗

將100 mL產酸培養基分裝250 mL錐形瓶中，按2%接種量接種初篩得到的6株醋酸菌，設置不同的溫度梯度(30、33、36、39、42 ℃)、乙醇體積分數(4、6、8、10、12%)和乙酸質量濃度(0、10、20、30、40、50、60 g/L)，130 r/min培養6 d，測定菌株的生物量OD600和相應產酸量。每個梯度重復3次，取平均值。

1.3.4 遺傳穩定性試驗

醋酸菌在分離及保藏過程中容易發生突變，故需對其進行遺傳穩定性試驗。將初選菌株在平板上連續傳代6次，觀察菌落形態和個體特征。將各代菌株同時接種到乙醇體積分數為4%的基礎培養基中，30 ℃、130 r/min搖瓶發酵培養6 d，測定發酵液的產酸量(以醋酸計)，計算轉酸率，重復3次。

產酸培養基：酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min，冷卻后加入體積分數6%的無水乙醇。

基礎培養基：酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min。

1.3.5 菌種形態鑒定

(1)觀察菌落形態，記錄各菌株的菌落形態特征。

(2)將菌種進行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌種的菌體形態。

1.3.6 菌種分子生物學鑒定

對細菌的16S rDNA序列進行測序，從而鑒定優勢菌株的種、屬。將菌株的16S rDNA基因序列提交GenBank 數據庫，使用NCBI的BLAST檢測系統(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對序列同源性進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 產酸微生物的分離、純化

恒溫培養48～72 h后，菌落的生長情況如圖1所示。隨著稀釋倍數的增加，培養基上的菌落總數逐漸減少，當稀釋倍數為10-5時，產酸菌較為明顯且多為單菌落。此時將平板上出現溶鈣圈的單個菌落接入培養基，進行2～3純化后，共獲得54株產酸菌，其中醋酸菌22株、乳酸菌32株，保藏備用。

a-產酸菌株的分離篩選；b-產酸菌株的純化圖1 產酸微生物的分離純化Fig.1 Isolation and purification of acid-producing microorganisms

2.2 醋酸菌的產酸性能測定

醋酸菌株產酸量及轉酸率結果見表2，各菌株的產酸量及轉酸率差別較大，菌株A14的酒精轉化率最高，為57.49%，轉酸率最低的是菌株A1，為37.08%。22株醋酸菌中有10株菌的產酸能力高于對照菌株。對產酸量在30.00 g/L以上的6株菌(A5、A10、A14、A16、A18、A20)進行環境耐受性分析。

表2 各醋酸菌株的產酸量及酒精轉化率比較Table 2 The comparison of acid producing and alcohol conversion rate between different AAB strains

2.3 醋酸菌的環境耐受性分析

在一定的范圍內，培養溫度的上升會有利于醋酸菌的生長和代謝，而溫度過高則會使醋酸菌產酶能力降低甚至喪失，從而導致產酸下降[14]。圖2-a顯示，隨著培養溫度的上升，6株醋酸菌的吸光度值呈現出3種變化趨勢，即A14、A20先保持平穩后快速下降，A5、A16先略微升高后快速下降，A10、A18先快速下降后保持平穩。由圖2-b可知，菌株A14的產酸量最高且溫度耐受性較好，在42 ℃的培養溫度中，其產酸量仍能達到(26.54±0.05)g/L，其次為菌株A16和A20。A18的最適發酵溫度為30 ℃，其他5株菌在培養溫度為33 ℃時產酸量最大。

酒精度耐受試驗發現，初篩醋酸菌的OD值隨著酒精濃度的上升均呈較緩慢的降低趨勢(圖2-c)。各菌株的產酸量隨著乙醇濃度增長，表現出不同的變化。菌株A5、A14和A18的產酸量先增加，分別在乙醇體積分數6%和8%時達到最大，之后產酸量下降(圖2-d)。其他3株菌隨著乙醇濃度的增加，產酸量呈下降趨勢，說明A10、A16及A20的酒精耐受性較差。當發酵液中的乙醇體積分數達到12%時，6株菌可以存活，但其代謝受到明顯的抑制，基本不生成酸。

過酸和堿性的環境都會導致相關酶活性下降，從而影響醋酸菌的生長和產酸能力[15]。隨著培養液中乙酸濃度的上升，初篩菌株的OD600值均逐漸減小(圖2-e)。釀醋生產過程中，發酵液中的總酸含量會隨醋酸發酵進程而逐漸升高，從而對參與發酵的微生物產生一定抑制作用。圖2-f顯示，當發酵液中的乙酸含量超過3.0 g/100mL，6株醋酸菌仍然存活但產酸能力均明顯減弱，與謝錦明等[16]陜西民間醋醅中篩選的醋酸菌耐酸性基本一致；當發酵液中的乙酸含量達到6.0 g/100mL，醋酸菌基本停止繁殖及代謝活動。

2.4 醋酸菌的遺傳穩定性

由表3可以看出，經過傳代培養后，各菌株每代的產酸量均發生變化。菌株A20各代發酵后的轉酸率均有降低，且變化幅度較大；而菌株A14各代之間的產酸率沒有明顯的差異，遺傳性能較穩定。綜上，確定菌株A14為醋酸發酵優勢菌種。

2.5 乳酸菌的產酸性能測定

由表4可知，32株乳酸菌的產酸量差異明顯，其中菌株L14的產酸量最高，為(9.94±0.34)g/L；而菌株L8的產酸能力最差，僅(0.83±0.01)g/L。試驗比較發現，乳酸菌代謝產物乳酸的生成量要遠低于醋酸菌轉化乙醇生成醋酸的量，說明AAF階段，醋酸菌的數量雖然不及乳酸菌多，但其具有較高的轉酸率，發酵液中乙酸的積累速度快于乳酸的積累速度。對產酸量高于9.00 g/L的菌株L4、L19、L11和L20進行環境耐受性分析。

2.6 乳酸菌的環境耐受性分析

圖3-a的結果顯示，初篩獲得的4株乳酸菌對溫度的反應大體相同，其吸光度值在渡過一個平穩期后均隨著溫度的上升呈逐漸下降趨勢。當培養溫度為30～40 ℃，OD600值基本保持不變；當溫度超過40 ℃后，其繁殖及代謝開始受到抑制。通過溫度耐受性測試，發現菌株L9和L11的溫度耐受性較好，在50 ℃的環境中仍然保持相對較高的產酸能力(圖6-b)，初篩乳酸菌的最適產酸溫度均為35 ℃。

a-不同溫度梯度菌株的生物量;b-不同溫度梯度菌株的產酸量;c-不同乙醇濃度菌株的生物量;d-不同乙醇濃度菌株的產酸量;e-不同乙酸含量菌株的生物量;f-不同乙酸含量菌株的產酸量圖2 六株醋酸菌菌株的環境耐受性Fig.2 Environmental tolerance of six AAB strains

表3 傳代菌種產酸量 單位：g/L

圖3-c和圖3-d是初篩乳酸菌對乙醇的耐受性測試結果，菌株L4及L20受乙醇的影響較大。與不含乙醇的發酵條件相比，當培養液中的乙醇體積分數為3%時，這2株菌的乳酸生成量分別降低了37.22%和43.36%。體積分數3%的乙醇對L9的產酸能力基本沒有影響，當培養液中的乙醇體積分數達到12%時，菌株L9和L11的乳酸生成量分別降低了25.94%和30.13%，具有較好的乙醇耐受能力。

圖3-e和圖3-f顯示的是乳酸菌對乙酸的耐受性結果，4株乳酸菌對乙酸的存在較為敏感、耐受能力均較差，當發酵液中乙酸的含量超過2.0 g/100 mL后，乳酸菌的繁殖和代謝基本停止。4株菌中，L9的乙酸耐受性最好，初始產酸量為(9.56±0.25)g/L，隨著發酵液乙酸含量的升高，其產酸量迅速下降，當發酵液中的乙酸質量濃度為5.0 g/100mL，其產酸量僅為(1.54±0.01)g/L，代謝基本停止。綜上，篩選出的優良產酸菌株為醋酸菌A14和乳酸菌L9。

表4 不同乳酸菌的產酸量比較 單位：g/L

a-不同溫度梯度菌株的生物量;b-不同溫度梯度菌株的產酸量;c-不同乙醇濃度菌株的生物量;d-不同乙醇濃度菌株的產酸量;e-不同乙酸含量菌株的生物量;f-不同乙酸含量菌株的產酸量圖3 四株乳酸菌菌株的環境耐受性Fig.3 Environmental tolerance of four LAB strains

2.7 菌株A14和L9的鑒定

2.7.1 菌落形態

如圖4所示，在平板培養基中，醋酸菌菌落呈白色，圓形，中間有凸起，菌落直徑0.32～1.02 mm，周圍有明顯的透明圈；乳酸菌菌落呈白色，圓形，菌落直徑0.58～3.07 mm，中間有凸起，表面有光澤。

a-A14；b-L9圖4 菌株A14和L9的菌落形態Fig.4 The colony morphology of A14 strain and L9 strain

2.7.2 菌體形態

對分離到的細菌進行革蘭氏染色，然后在顯微鏡下進行觀察，結果如圖5所示。菌株A14經革蘭氏染色后呈紅色，陰性，微生物顯微形態呈桿形，周邊無芽孢，以單個或成對方式排列；而菌株L9革蘭氏染色后呈紫色，陽性，微生物菌體形態呈球狀，對生或成鏈狀排列，周邊無芽孢。

2.7.3 16S rDNA鑒定

對篩選出來的2株菌株進行16S rDNA基因序列分析鑒定，提取其基因組DNA，進行PCR擴增。將待測序菌株的PCR產物純化后送至上海生工有限公司進行序列分析，待測序結果出來后，將其序列提交到NCBI基因庫，通過BLAST程序進行堿基同源序列檢索，對菌株進行同源性比較。表5的比對結果表明菌株A14與巴氏醋桿菌(AcetobacterpasteurianusCP021922.1)的同源性為99.85%，L9與戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusJN039348.1)同源性為100%。結合菌落形態、菌體形態和16S rDNA技術手段，鑒定菌株A14為A.pasteurianus，L9為P.pentosaceus。

表5 目標菌株比對情況Table 5 Phylogenetic identification of target strains

3 討論

在對分離到的乳酸菌和醋酸菌進行產酸性能的測試過程中，發現醋酸菌的產酸能力明顯高于乳酸菌，分離醋酸菌株的最低產酸量為(22.90±0.21)g/L，而乳酸菌中最高能產酸(9.94±0.34)g/L，產酸能力最差的僅(0.83±0.01)g/L。這說明在醋酸發酵階段，雖然乳酸菌的豐度遠高于醋酸菌，但醋醅中總酸的快速上升主要是由于乙酸的積累，而不是乳酸的原因。同時，乳酸菌對乙酸較敏感，耐酸能力不及醋酸菌，推測可能是醋酸菌利用乙醇生成的乙酸能輕易穿透乳酸菌的細胞膜引起細胞死亡[17]。此外，亓正良等[18]對A.pasteurianus在醋酸發酵過程中能量代謝的研究發現，添加琥珀酸和蘋果酸可以提高醋桿菌耐酸能力和醋酸生產能力，強化細胞產能，從而使菌株在高酸環境中繼續發酵產酸。山西老陳醋釀造過程中琥珀酸、蘋果酸的生成，可能是醋酸菌耐酸能力強、產酸高的另外一種原因，具體機理還有待繼續研究。

本課題組前期的微生物統計結果表明[19]，成熟酒醪中依然存在大量的乳酸菌和醋酸菌，它們在酒精發酵階段受高濃度乙醇(體積分數8%～9%)的脅迫，存活但基本不產酸或產酸很少，經過長期的適應，對乙醇的耐受能力逐漸提高，可以耐受體積分數12%的乙醇。分離到的乳酸菌和醋酸菌在高溫(>42 ℃)條件下都能存活，可能與山西老陳醋高溫醋酸發酵工藝有關，產酸菌經過長期的高溫馴化，對溫度的耐受能力也逐漸增強。有研究表明[20-21]，從食醋醋醅中分離獲得的A.pasteurianus普遍具有高耐受性，可以耐受體積分數12%的乙醇及43 ℃的高溫，與本試驗的研究結果一致。液態食醋和果醋發酵通常是將純菌種接種至高乙醇含量的發酵液中，由于同種微生物快速繁殖、集中代謝，勢必會導致發酵液中積累較高濃度的乙酸，同時釋放大量的熱，這就要求主體發酵微生物具有較好的環境耐受性。參與山西老陳醋發酵的微生物經過長期高溫、高酸環境的馴化，具有較好的耐受性，且致病性較低，因此本研究篩選出來的醋酸菌和乳酸菌在液態食醋和果醋發酵方面具有很大的應用潛力，可制成菌劑進行初試試驗。

4 結論

采用純培養方式對山西老陳醋醋酸發酵過程中的產酸微生物進行了分離純化，共獲得54株產酸菌。對分離得到的22株醋酸菌和32株乳酸菌進行了產酸能力測試及環境耐受性分析，篩選出的醋酸菌經菌落形態、菌體形態和16S rDNA序列分析法鑒定為巴氏醋桿菌，產酸能力為(35.5±0.48)g/L，能耐受42 ℃高溫、體積分數10%的乙醇和5.0 g/100mL的乙酸，且遺傳性能較穩定；篩選出來的優勢乳酸菌經鑒定后為戊糖片球菌，其產酸能力為(9.56±0.23)g/L，能耐受50 ℃高溫和體積分數12% 的乙醇。